[发明专利]一种防掉片细胞DNA定量染色方法

说明书

本发明提供了一种防掉片细胞DNA定量染色方法，优选酸解‑碱结合的方式，一一对应的在原位形成蓝紫色醌类化合物，在590±15nm的酸性水溶液中具有最大吸收峰，测定吸光度即可得知细胞核内DNA含量或倍体以此来判断细胞的生理状态和病理改变。通过水洗避免了试剂残留，降低酸碱醇对载玻片黏附层的影响；通过烘烤避免了水分残留，避免了水与载玻片之间形成氢键而降低载玻片对目的细胞、组织的吸附力；以及通过脱色、脱水、干燥的操作，加速了分子间的相互震动，促使氢键的形成即细胞、组织与载玻片紧密粘合，保证了载玻片不出现掉片现象，保障了取样标本结果的完整性。

技术领域

本发明涉及一种细胞DNA定量检测的染色方法，尤其涉及一种防掉片细胞DNA定量染色方法。

背景技术

脱氧核糖核酸(DNA)染色方法有Feulgen法、甲基绿-派洛宁法、吖啶橙荧光法等，其中最经典的是Feulgen法，Feulgen染色由Feulgen和Rossenbeck在1924年发现的一种细胞核内DNA染色技术。该法是一种经典的酶组织化学法。Leagene Feulgen stain原理在于：DNA经弱酸(1mol/L HCl)水解后，嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键被打开，并且使脱氧核糖与磷酸间的磷酯键断开，在脱氧核糖的一端形成游离的醛基。醛基在原位与Schiff(无色品红亚硫酸溶液)试剂结合，形成紫红色化合物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生是因为反应产物的分子内有醌基(醌基是一个具有颜色的发色团)，所以凡含有DNA的部位，就呈紫红色。而RNA用此法处理后则分解。Feulgen染色使DNA特异性着色。其染色的深浅与DNA的含量或倍体成正比。

细胞DNA定量分析技术主要通过对细胞核内DNA进行特异性染色、仪器测定细胞核内DNA含量或倍体来判断细胞的生理状态和病理改变。DNA定量细胞学在宫颈癌、口腔鳞癌、头颈部肿瘤、颈部淋巴结肿大、乳腺癌、胃癌、肺癌、泌尿系肿瘤、胸腹积液的临床应用及研究中有重大意义。

因传统方法中由载玻片承载的组织、细胞经酸解、固定、水洗等操作后，极易出现不同程度的载玻片掉片(即组织、细胞等标本从载玻片上部分或全部脱落缺失的现象)，造成假阴性的情况，直接影响结果的判定甚至降低方法学的准确性。为此，科研人员研发了各类防脱载玻片，例如CN201921220040.1、CN201521113399.0等所设计的防脱载玻片通过提高洁净度、增加黏附层、增设卡槽等手段对液基细胞学、组织染色等出现的掉片现象有大幅改善。

然而，由于传统方法染色过程繁琐，极易受组织固定液种类、酸解时间和温度的影响，仅仅通过增强黏附力防止掉片是治标不治本的，防脱载玻片的脱片仍时有发生。方法学中冷、热、酸、碱、醇对于防脱载玻片的影响仍未得到根本解决。因碱性Schiff特异性不高，背景易出现共染现象，影响结果的判定，降低准确性。

发明内容

为了解决上述技术所存在的不足之处，本发明提供了一种防掉片细胞DNA定量染色方法。

为了解决以上技术问题，本发明采用的技术方案是：

一种防掉片细胞DNA定量染色方法，包括以下步骤：

1)采用梯度离心沉降法制片，包括：

1-1)样本确认并相应编号；

1-2)将样品瓶充分振荡；

1-3)沿沉降仓壁或滤杯壁向沉降仓中加入1-2.5ml分离液，吸取1-2.5ml样品-保存液沿滤杯壁加入，800-2000rpm，离心1-5min；

1-4)去掉过滤网，弃上清液，轻轻甩干，旋转取下沉降仓，取出载玻片于染色架；

1-5)流水冲洗；

1-6)恒温烘烤10-30min；

2)染色，包括：