[发明专利]一种USP7抑制剂在治疗ABC-DLBCL药物中的应用

权利要求书

1.一种USP7抑制剂在治疗ABC-DLBCL药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的一种USP7抑制剂在治疗ABC-DLBCL药物中的应用，其特征在于步骤为：

第一步，USP7表达与ABC型DLBCL的关系：确定USP7是否与ABC型DLBCL相关，首先研究USP7在DLBCL细胞系中的表达情况，然后通过数据库分析USP7在肿瘤组织中的表达情况；

第二步，明确USP7是否参与ABC型DLBCL的发生发展及其所发挥的具体作用：用USP7小分子抑制剂抑制USP7活性，CCK-8法观察ABC型DLBCL细胞增殖、PI染色和流式细胞术检测细胞凋亡的影响及应用Western blot、Real-time PCR 方法检测抑制剂对ABC型DLBCL BCR信号通路的影响，具体实施步骤为：

CCK-8检测：取对数生长期的细胞，完全培养基重悬，细胞计数；取无菌 96 孔板，设计0uM、0.5uM、1uM、5uM、10uM、20uM 六个P22077浓度组，每个浓度 4 个副孔；每孔接种 2×10⁴cells，加含上述浓度药物的完全培养基至 200μl，37℃、5%CO₂条件下继续培养48h，在各孔内加入 20μl CCK-8试剂，37℃孵育 4 小时；取出 96 孔板，放入酶标仪，设置检测波长为 450nm，检测并纪录 OD450 读数；

PI染色实验：取对数生长期细胞，以20000细胞／孔接种于96孔扳，同时给药处理，培养24或48h后加入终浓度为50uｇ／ｍＬ的ＰＩ染料，避光染色10min，采用荧光显微镜观察拍照；

流式细胞术：6 孔板内接种对数生长期的各组细胞，培养 24 小时；重悬后收集每孔细胞于单支的流式管内，离心去上清，PBS 洗涤细胞 2 次，每管中缓慢加入 1ml、-20℃预冷的 70%乙醇， 4℃过夜；离心去除乙醇，PBS 洗涤细胞，离心 5min；每管加入 500μl PI/RNase Staining Buffer 重悬细胞，室温下避光孵育 15min后上机检测；

应用Real-time PCR、Western blot方法检测抑制剂对ABC型DLBCL BCR信号通路的影响：用10uM P22077处理ABC型DLBCL细胞（HBL），分别提取mRNA和蛋白，Real-time PCR法检测 BTK, PLCG2, PKC 和 CD79B 及BCR-NFkB 信号通路靶基因IL-6, MYC, BATF3 和IRF4的mRNA水平；Western blot方法检测BTK和PLCG2的蛋白水平。

3.根据权利要求2所述的一种USP7抑制剂在治疗ABC-DLBCL药物中的应用，其特征在于：所述第一步中研究USP7在DLBCL细胞系中的表达情况具体步骤为应用Western blot方法检测ABC型DLBCL及GCB型DLBCL细胞系中USP7 蛋白表达，和GCB-DLBCL亚型相比USP7在ABC型DLBCL中高表达，这种表达差异证实USP7参与ABC-DLBCL的发生。

4.根据权利要求2所述的一种USP7抑制剂在治疗ABC-DLBCL药物中的应用，其特征在于：所述第一步中数据库分析显示和癌旁组织相比，USP7在肿瘤组织中高表达。

5.根据权利要求2所述的一种USP7抑制剂在治疗ABC-DLBCL药物中的应用，其特征在于：USP7小分子抑制剂P22077可明显诱导DLBCL特别是ABC-DLBCL（HBL-1、SU-DHL-2）发生凋亡。