[发明专利]MTHFR基因rs1801133多态性位点KASP分型检测的引物及试剂盒

说明书

本发明提供MTHFR基因rs1801133多态性位点KASP分型检测的引物及试剂盒，所述引物包括用不同荧光标记二条正向KASP引物和一条通用反向KASP引物。本发明的试剂盒可用于1个及以上样本的rs1801133位点基因型分型的检测分析，适合小通量、中通量、高通量样本的检测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及MTHFR基因rs1801133多态性位点KASP分型检测的引物及试剂盒。

背景技术

亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenete-trahydmfolate reductase，MTHFR)，催化5，10-亚甲基四氢叶酸转化为5-甲基四氢叶酸，后者是同型半胱氨酸再甲基化为蛋氨酸代谢中的物质。MTHFR基因的突变与亚甲基四氢叶酸还原酶缺乏有关，相应引起叶酸代谢水平下降及同型半胱氨酸水平的累积。多项研究现已证明，同型半胱氨酸是心脑血管疾病的独立危险因素。心脑血管疾病是严重威胁人类健康的疾病之一。中国心脑血管疾病死亡率居于疾病死亡构成的首位，高于肿瘤及其他疾病，每5例死亡中就有2例死于心脑血管疾病。其中脑卒中是我国成年人致死和致残的首位原因。

北京大学第一医院霍勇教授的研究团队近20余年的研究表明，我国脑卒中高发的原因主要为：高血压，高血同型半胱氨酸水平、低叶酸水平和MTHFR基因677TT基因型比例高。通过补充叶酸可以显著降低我国新发卒中风险，且若想起到相同的降低卒中风险，677TT基因型比677CC/CT基因型补充的需求量大。其中MTHFR基因677TT基因型，即rs1801133位点TT基因型作为卒中发生的易感风险因素，对卒中风险预警及卒中预防指导具有重要意义。因此，建立一种准确、灵活、快速且经济的MTHFR基因rs1801133位点基因型的分型方法，显得尤为重要。

目前SNP分型的主要方法中，新一代测序技术NGS和芯片技术较适合多位点、少量样本的高通量检测。一代测序技术即Sanger测序作为金标准，但价格昂贵。已有的类似专利使用巢式PCR加限制性内切酶技术涉及多次开盖加样，过程繁琐且耗时。Taqman探针检测方法快速准确，但单次合成探针费用昂贵。

发明内容

本发明采用近几年国际兴起的KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR)分型技术，即竞争性等位基因特异性PCR，该方法同Taqman探针方法类似，同样采用双荧光标记，但KASP技术使用通用探针，位于反应混合液中，只需合成普通末端特异性碱基引物即可进行检测。KASP基于终端荧光信号的读取判断，每孔反应都是采用双色荧光检测一个SNP位点的两种基因型，不同的SNP对应着不同的荧光信号。

KASP技术与TaqMan法类似，它与TaqMan技术不同的是，它不需要每个SNP位点都合成特异的荧光引物，它基于独特的ARM PCR原理，所有的位点检测都可以使用通用荧光引物进行扩增，这降低了KASP技术的试剂成本，既有准确度，又降低了成本，更具SNP位点适用性。KASP技术具有准确、快速的特征外，同时具备灵活、经济的特点。

在一种实施方式中，本发明提供MTHFR基因rs1801133多态性位点KASP分型检测的引物，所述引物包括用不同荧光标记二条正向KASP引物和一条通用反向KASP引物，二条正向KASP引物是SEQ ID NO.4：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT AGCTGCGTGATGATGAA ATCGG；SEQ IDNO.5：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAGCTGCGTGATGATGAAATCGA；和一条通用反向KASP引物是SEQID NO.6：GCACTTGAAGGAGAAGGTGTCT。

在一种实施方式中，二条正向KASP引物和一条通用反向KASP引物按照12:12:30的物质量比例加入反应体系。

在一种实施方式中，本发明提供二条正向KASP引物一条用FAM标记，另一条用HEX标记。