[发明专利]一种脊髓成纤维细胞的制备方法

说明书

本发明公开了一种脊髓成纤维细胞的制备方法，1)取脊柱组织，用含双抗的磷酸盐缓冲液清洗至无血细胞，再用培养液冲洗至椎管中无脊髓；2)取步骤1)所得干净组织，剪成块，加含双抗的磷酸盐缓冲液离心，取下层组织块，加胰蛋白酶溶液消化，再加培养液离心，取下层固体，加培养液重悬；3)取步骤2)所得重悬细胞，接种于培养液中培养至细胞密度达85～95％，用胰蛋白酶溶液消化后重铺细胞，再培养30～40min，弃去培养液和未贴壁细胞，加培养液培养至细胞密度达85～95％，即得。本发明脊髓成纤维细胞的制备方法，简便高效，制备得到的脊髓成纤维细胞纯度高。

技术领域

本发明具体涉及一种脊髓成纤维细胞的制备方法。

背景技术

脊髓损伤(SCI)是脊柱损伤最严重的并发症，导致损伤节段以下肢体严重的功能障碍，不仅会给患者本人带来身体和心理的严重伤害，还会给整个社会造成巨大的经济负担，针对脊髓损伤的治疗和康复一直是当今医学界的研究热点和难点。

SCI后神经元轴突的再生是损伤后修复的细胞学基础和神经功能恢复的关键，其中提高轴突内生力、缩短轴突再生时间是SCI后神经功能恢复的保障。SCI后轴突的再生不仅要穿过损伤区域连通失神经支配的靶点，还要生成新的突触并形成有效的突触传递。以上再生过程主要与SCI后微环境中神经营养因子、髓磷脂相关抑制因子以及瘢痕形成有密切关系。研究证实，SCI后瘢痕形成对轴突再生和神经功能恢复起到主要的抑制作用，瘢痕的形成是一系列、动态、复杂的过程。在损伤后7天左右，成纤维细胞(fibroblasts)由损伤区域临近的硬脊膜和血管外周细胞的入侵，而后激活、增生肥大，最终形成纤维瘢痕，其对突触再生和功能恢复起着机械屏障和生物抑制作用：(1)活动性增生肥大且分泌细胞外基质(extracellular matrix,ECM)，包括：IV型胶原、纤维连接蛋白和层粘连蛋白等，形成阻碍突触生长的机械屏障；(2)分泌多种的突触生长抑制分子：NG2蛋白聚糖、肌腱蛋白C、semaphorin 3A和EphB2等，形成了阻碍功能恢复的生物障碍。通过抑制成纤维细胞的激活和增殖，实现抑制SCI后纤维瘢痕的形成，可以为轴突再生创造良好的微环境。

目前作为研究基础的脊髓成纤维细胞难以获得，市面上尚未有脊髓成纤维细胞系，亦未有见针对原代脊髓成纤维细胞的提取的公认、公开、可行的方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种脊髓成纤维细胞的制备方法，它包括如下步骤：

1)取脊柱组织，用含双抗的磷酸盐缓冲液清洗至无血细胞，再用培养液冲洗至椎管中无脊髓；

2)取步骤1)所得干净组织，剪成块，加含双抗的磷酸盐缓冲液离心，取下层组织块，加胰蛋白酶溶液消化，再加培养液终止消化，离心，取下层固体，加培养液重悬；

3)取步骤2)所得重悬细胞，接种于培养液中培养至细胞密度达85～95％，用胰蛋白酶溶液消化后重铺细胞，再培养30～40min，弃去培养液和未贴壁细胞，加培养液培养至细胞密度达85～95％，即得。

进一步地，步骤1)所述脊柱组织是包含脊髓的新鲜脊柱组织。

进一步地，所述含双抗的磷酸盐缓冲液是含1％双抗的磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/L，pH值7.4。

进一步地，所述培养液是含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM细胞培养基。

进一步地，步骤2)所述干净组织剪成0.5-1mm³的块状；所述干净组织与含双抗的磷酸盐缓冲液的质量体积比1～5g：10ml，优选1g：10ml；所述加含双抗的磷酸盐缓冲液离心的速度1000rpm/min，时间3min。