[发明专利]一种电沉积金和铂-氧硫化铜检测胰岛素的电化学传感器的制备方法

权利要求书

1.一种电沉积金和铂-氧硫化铜检测胰岛素的电化学传感器的制备方法，其特征在于，电化学免疫传感器的制备包括以下步骤：

(1) 将直径为4 mm的玻碳电极分别用0.05、0.3和1.0 mm氧化铝粉打磨抛光至镜面，再超纯水洗涤干净；

（2）将玻碳电极放在0.01~ 0.03 mmol/L的氯金酸电化学沉积液中，沉积过程中利用计时电流方法，在-0.6 V的条件下沉积 100 s 后用超纯水清洗，在电极表面沉积金纳米粒子；

（3）继续滴涂3 µL、浓度为10 μg/mL的胰岛素抗体标准溶液于玻碳电极表面，4 ºC冰箱中孵育12 h，超纯水清洗；

（4）继续滴涂3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液来封闭非特异性活性位点，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；

（5）继续将6 μL、浓度为0.5 fg/mL～50.0 ng/mL的一系列不同浓度的胰岛素抗原标准溶液滴涂在电极表面，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗；

（6）继续滴加1.0 mg/mL~3.0 mg/mL的铂修饰的硫氧化铜二抗标记物，4 ºC冰箱中保存至干燥，超纯水清洗。

2.如权利要求书1一种电沉积金和铂-氧硫化铜检测胰岛素的电化学传感器的制备方法，所述电极表面电沉积金纳米粒子和铂修饰氧硫化铜等材料的制备方法，步骤如下：

（1）电极表面电沉积金的合成

1）将玻碳电极放在 0.01~ 0.03 mmol/L的氯金酸电化学沉积液中，沉积过程中用计时电流方法，在-0.6 V的条件下沉积 100 s 后用超纯水清洗，在电极表面沉积了金纳米粒子；

（2）铂修饰氧硫化铜（Pt@CuOS）的制备

（1）花状氧硫化铜的制备

在磁力搅拌的条件下，将4.5 g 三水合硝酸铜加入到500 mL水溶液中；再将1.5 g硫代乙酰胺加入到上述的500 mL溶液中；30 min后，将该溶液加热到90 ºC；再加入0.12 mL肼搅拌2 h后得到沉淀固体，用去离子水洗涤直至洗涤液pH为7后再用乙醇清洗数次去除有机物；将所得固体样品放在真空干燥箱干燥24 h，研磨后得到花状氧硫化铜纳米材料；

（2）铂纳米粒子的制备

铂纳米粒子是通过将四氯铂酸钾溶液加入到抗坏血酸和溴化钾的溶液中还原制备的；将105 mg的聚乙烯吡咯烷酮，20 mg～40 mg的抗坏血酸和200 mg～400 mg的溴化钾溶解在去离子水中, 将该溶液用油浴加热到90 ºC，并且保持10 min；然后用滴管逐滴加入含四氯铂酸钾（20 mg～40 mg）的3.0 mL水溶液，并且将这一反应在80 ºC保持3 h，洗涤离心后将其溶解在10 mL的去离子水中；

(3) 铂纳米粒子功能化氧硫化铜纳米材料的制备

将100 μL～300 μL的铂纳米粒子溶液加入到 2 mL的1.0 ~ 2.0 mg/mL的氧硫化铜溶液中，在室温下振荡24 h, 离心分离后的产物经多次水洗去除多余的铂纳米粒子，再分散于去离子水中（2 mL）得到铂纳米粒子功能化花状氧硫化铜溶液。

3.如权利要求1所述的 0.5 fg/mL～50.0 ng/mL的一系列不同浓度的胰岛素标准溶液为从南京金斯瑞生物科技有限公司购得的1 mg/mL的胰岛素溶液用磷酸盐缓冲溶液稀释得到。

4.如权利要求1所述的胰岛素的检测，其特征在于，检测步骤如下：

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电沉积金作为基底，铂纳米粒子功能化花状氧硫化铜电化学免疫传感器为工作电极，在10 mL的pH 为4.0～9.0磷酸盐缓冲溶液中测定其电流变化；

（2）电化学工作站参数设置为，扫描电位为-0.2~0.6 V，扫描速率设置为0.1 ~0.3 V/s；

（3）使用含10 mL的0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液作为底液，通过差分脉冲伏安法检测不同浓度的胰岛素产生的电化学电流信号强度；所述磷酸盐缓冲溶液，其pH为7.4，用0.1mol/L磷酸氢二钠和0.1 mol/L磷酸二氢钾配制；

（4）根据所得电流值与胰岛素浓度呈线性关系，绘制工作曲线；

（5）依据工作曲线的绘制方法进行样品中胰岛素的检测，检测结果从工作曲线中查得。