[发明专利]一种可用于异种器官移植的供体猪的构建方法

说明书

本发明涉及动物基因工程领域，尤其涉及一种可用于异种器官移植的供体猪的构建方法。本发明的构建方法包括以下步骤：(1)在猪胎儿成纤维细胞的基础上，敲除GGTA1基因，同时转入基因HLA‑G5，得到GTKO/HLA‑G5+克隆细胞；(2)将GTKO/HLA‑G5+克隆细胞作为核供体进行体细胞核移植，培育得到重组胚，将重组胚移植入代孕母猪，妊娠后产仔得到供体猪。本发明构建了具有重要科研价值和应用前景的基因敲除和转基因GTKO/HLA‑G5+克隆猪，为异种器官移植提供重要的研究工具和新的研究途径。

技术领域

本发明涉及动物基因工程领域，尤其涉及一种可用于异种器官移植的供体猪的构建方法。

背景技术

随着基础研究的不断深入和临床研究的日益完善，器官移植已经成为治疗终末期器官疾病的首选之法。临床医学的发展和免疫抑制剂的开发，更使得同种器官移植获得了显著疗效。但器官资源的严重短缺阻碍了同种器官移植的广泛应用，据统计，目前全球等待移植的病人有600多万人，病人数目还在不断增加，发达国家的器官供应只能满足15％的需要，约五分之一的病人在等待中死亡。日益突出的器官资源供求矛盾使异种器官移植研究应运而生。科学家们普遍认识到如果动物器官也能用于器官移植的话，那器官的来源问题将不再是难题。

目前，许多大动物已被应用于异种器官移植研究，猪，猴，猩猩，狒狒等，其中又以猪的研究最为广泛。究其原因，以猪的器官作为异种供体源，因其有着得天独厚的条件：其一，猪的同类器官与人的器官相比大小形态基本一致；其二，猪的繁殖周期短，生产力高，一窝产仔多；其三，与灵长类动物相比伦理问题相对较少。因此猪被认为是最理想的研究对象。虽然猪的器官结构和大小与人的器官相似，并可能作为异种器官移植的供体来解决器官短缺的问题，但是如果直接把正常的未经修饰的猪的器官移植到病人体内的话，会产生一系列免疫排斥反应，比如超急性排斥反应(HAR)，急性血管性排斥反应(AVR)，急性细胞排斥反应(ACR)等。解决这一问题的关键在于如何对猪的器官进行人源化改造，使其不被受体的免疫系统所排斥。

GGTA1，α-1，3-半乳糖基转移酶基因，其催化生成的α-Gal是超急性排斥反应(Hyperacuterejection，HAR)的诱因。抗原α-Gal存在于猪和其它低等动物的细胞表面，由GGTA1基因调控。人体内不具有α-Gal抗原，但血清中存在大量的抗α-Gal抗体。因此如果进行猪-人异种器官移植，人体内该种抗体将与存在于异种物血管内皮细胞表面的异种抗原特异结合，引起凝血连锁反应，特征为移植物短时间内出血、水肿、衰竭。因此在猪-人异种器官移植中会导致 HAR。移植实验研究发现，取自GGTA1基因敲除猪的心或肾，移植到已免疫抑制的狒狒体内，分别成活179d和83d，与以往的实验结果相比，延长了器官的存活时间，且都克服了HAR，因此敲除猪的GGTA1基因是克服猪异种器官移植免疫排斥反应的第一步。

异种器官移植过程中，NK细胞、CD4+和CD8+T细胞等免疫细胞的功能状态决定了移植物的命运。HLA-G作为一种免疫耐受分子，可与这些免疫细胞表面的特异性受体相互作用，抑制受体的免疫应答作用，延长移植物的存活时间，在移植免疫耐受产生与维持中发挥重要作用。

发明内容

本发明对猪成纤维细胞进行GGTA1基因敲除，同时转入HLA-G5基因，通过体细胞核移植技术获得GGTA1基因敲除且转HLA-G5的克隆猪，为异种器官移植提供新的研究工具和研究途径。

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种可用于异种器官移植的供体猪的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：

(1)在猪胎儿成纤维细胞的基础上，敲除GGTA1基因，同时转入基因 HLA-G5，得到GTKO/HLA-G5+克隆细胞；

(2)将GTKO/HLA-G5+克隆细胞作为核供体进行体细胞核移植，培育得到重组胚，将重组胚移植入代孕母猪，妊娠后产仔得到供体猪。