[发明专利]一种微小核糖核酸miR-34a偶联探针及其制备方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体为一种微小核糖核酸miR‑34a偶联探针及其制备方法，首先将3‑3’二硫代二丙酸进行溶解，并向其中加入二环己基碳二亚胺（DCC）及N‑羟基琥珀酰亚胺（NHS），室温反应后进行过滤，蒸干溶剂得到中间产物；得到的中间产物溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，并向其中加入3’‑氨基修饰miR‑34a、3’‑氨基修饰AS1411以及N,N'‑异丙基乙胺（DIPEA）；充分混合反应得到反应物混合液，最后通过高效液相色谱分离得到miR‑34a偶联探针；本发明的技术方案能够提供对细胞毒性影响小、靶向运输快速高效、释放效率高且制备方便的微小核糖核酸miR‑34a偶联探针及其制备方法。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种微小核糖核酸miR-34a偶联探针及其制备方法。

背景技术

微小核糖核酸（英文为microRNA, 简称miRNA）是一类细胞内源性的小分子RNA，长度约为22个核苷酸，其可以在转录后水平调控基因的表达。近年相关研究发现，miRNA可以调节约60%的人类基因表达，miRNA的异常表达会引起下游癌相关基因表达的紊乱。因而，对这些异常表达miRNA的调节具有重要的应用价值。

以化学合成的miRNA类似物对细胞内的miRNA类似物进行调节是一种行之有效的策略，且因其长度较短，miRNA类似物的化学合成并不需要复杂工序条件要求，且可以通过化学修饰引入多种功能性基团实现丰富miRNA类似物的生物学特性。然而在实际合成制备中，由于miRNA类似物等寡核苷酸因其亲水及负电性并不能自主跨越细胞膜进入细胞中发挥功能，因而在miRNA类似物的制备过程中，额外的载体不可或缺，常用的载体包括病毒、脂质体以及无机、有机纳米等；但是，病毒类载体具有潜在的生物不安全性，其它载体中因带有过量的阳离子聚合物或金属离子均会对细胞造成显著的毒性；这些载体均可能造成临床药物研发的失败，例如，miR-34a通过脂质体的方式运输在实际应用中就遭遇了强烈的副作用而导致研究终止。因此，发展高效且生物相容好的miR-34a探针以实现运输具有重要意义。

发明内容

本发明目的是为了克服现有技术的不足而提供一种对细胞毒性影响小、靶向运输快速高效、释放效率高且制备方便的微小核糖核酸miR-34a偶联探针及其制备方法。

下面关于后续技术方案表述中涉及的专业名词解释如下：

DCC是指二环己基碳二亚胺。

N-NHS是指N-羟基琥珀酰亚胺。

DMSO是指二甲基亚砜。

AS1411为富含G的寡核苷酸,可形成G-四重结构抗核酸酶降解,并与核仁素特异结合,进入细胞内干扰细胞的正常复制和增殖。

nM为一种物质浓度单位，等同于nmol/l，代表纳摩尔每升。

AMV是逆转录酶的名称，从Avian Myeloblastosis Virus分离出来,经过高度纯化,不含核酸酶，可用于合成第一链cDNA、制作cDNA探针、RNA转录、测序和RNA的逆转录反应。

buffer是指缓冲液。

RT-primer是一种逆转录引物，用于延长miRNA。

dNTP Mixture是由dATP、dTTP、dGTP、dCTP以等摩尔数混合制得，可直接用于PCR、RT-PCR、反转录第一链合成等常规分子生物实验。

DEPC H2O是焦碳酸二乙酯DEPC处理过的水，是一种RNA酶抑制剂。

PCR是指聚合酶链式反应，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。

HindIII及Spel均为常用类别的内切酶。