[发明专利]依降钙素的制备方法

说明书

本发明提供一种依降钙素的制备方法，包括以下步骤：1)由Fmoc‑Pro‑OH与Sieber Amide Resin反应；2)在Fmoc‑Pro‑Sieber Amide Resin树脂上按照依降钙素序列依次偶联至最后一个氨基酸Fmoc‑Ser(tBu)‑OH；3)脱除肽树脂的氨基酸Asu上的侧链保护基OAll，脱除Fmoc得到带侧链保护基的线性依降钙素树脂肽，将带保护基的线性依降钙素从树脂上脱落；4)溶液调节至中性，除去DCM，加入Cl‑HOBT与DIC充分反应；5)加水将带有侧链保护基的环状依降钙素析出，加入裂解液，加入冰乙醚沉淀；6)上制备分离纯化，得到纯度合格的液体依降钙素，将溶液转盐形成醋酸盐，冻干得到精品依降钙素。本发明制备方法简单，在液相条件下进行环化反应，大大提高了粗品纯度，有效提高了依降钙素的收率，降低了成本与“三废”排放。

技术领域

本发明涉及一种合成多肽的方法，具体涉及一种依降钙素的制备方法。

背景技术

依降钙素(Carbocalcitonin)是合成的鳗鱼降钙素的一种衍生物，在临床研究方面，以依降钙素为主要原料的药物具有防止骨钙丢失的作用，还能起到改善骨质疏松的效果。

依降钙素是一条由31个氨基酸组成的多肽，其中包含具有环状结构的片段，由N端第1个氨基酸Ser上的氨基与N端第6为氨基酸Asu的侧链羧基结合成酰胺键，从而形成相对稳定的环状结构。依降钙素的序列如下：

[Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Asu]-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-OH，(Ser-AsuLacton)；Cas.No.:60731-46-6，分子式：C148H244N42O47，分子量：3363.77。

现有技术有关依降钙素的制备方法并不多。在传统的生产工艺中，会遇到粗品纯度低、收率低等情况，甚至需要经过多次分离纯化才能得到合格依降钙素。而低收率、高成本是不利于大规模生产的，同时会产生大量“三废”污染环境。

因此，需要对现有技术进行改进。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种依降钙素的制备方法。本发明提出了一种较为合理的生产路线，使用固相、液相技术生产依降钙素，收率较高。

为解决上述技术问题，本发明提供一种依降钙素的制备方法，包括以下步骤：

1)由Fmoc-Pro-OH与Sieber Amide Resin反应，得到替代度为0.30-0.40mmol/g的Fmoc-Pro-Sieber Amide Resin树脂；

2)在Fmoc-Pro-Sieber Amide Resin树脂上按照依降钙素序列依次偶联至最后一个氨基酸Fmoc-Ser(tBu)-OH；得到肽树脂；

3)使用四三苯基磷钯脱除肽树脂的氨基酸Asu上的侧链保护基OAll，然后脱除Fmoc得到带侧链保护基的线性依降钙素树脂肽，用TFA/DCM裂解液将带保护基的线性依降钙素从树脂上脱落；得到TFA/DCM依降钙素溶液；

4)用DIEA将裂解得到TFA/DCM依降钙素溶液调节至中性，中和TFA，然后旋蒸除去DCM，将得到的油状依降钙素线性肽后溶于DMF中，加入Cl-HOBT与DIC使肽链N端氨基与N端第6位Asu侧链的羧基充分反应，得到带有侧链保护基的环状依降钙素；

Cl-HOBT与DIC之间的摩尔数量比为1:1。

5)加水将带有侧链保护基的环状依降钙素析出，抽滤得固体，加入裂解液反应2小时，加入冰乙醚沉淀得到粗品依降钙素；

6)上制备分离纯化，得到纯度合格的液体依降钙素，将溶液转盐形成醋酸盐，冻干得到精品依降钙素。