[发明专利]适用于地衣芽胞杆菌的启动子及其在高效表达目的产物中的应用

说明书

本发明涉及基因工程和微生物代谢工程领域，公开了适用于地衣芽胞杆菌的启动子及其在高效表达目的产物中的应用，本发明人工设计了四种适用于地衣芽胞杆菌的启动子（R1‑R4）。接着，以绿色荧光蛋白GFP、角蛋白酶KER为目的蛋白，与启动子P43相比，研究发现启动子R2效果最佳，显著提高了GFP、KER的表达水平，其中GFP产量提高63.5倍，KER酶活提高7.8倍。最后，将启动子R2应用于代谢工程中，与对照菌株相比，通过将其应用于代谢途径强化使聚γ‑谷氨酸、杆菌肽的产量分别提高了52.09％和20.39％。

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物代谢工程领域，具体涉及适用于地衣芽胞杆菌的启动子及其在高效表达目的产物中的应用。

背景技术

启动子是位于基因转录单元上游的一段特殊DNA序列，具有启动基因转录的功能，并在调控基因转录水平中发挥着重要的作用。随着合成生物学和代谢途径工程的发展，人们逐渐发现，为了实现目标产物的高产，强化目的蛋白的表达水平和目的代谢物的代谢通量是至关重要的。由于启动子是基因转录的开关，并被认定为是建立基因高效表达工具的主要表达元件，从而启动子改造是开发能优化蛋白表达水平和代谢物代谢途径技术的首选策略。目前，启动子改造策略主要围绕着σ因子识别和结合的启动子核心区(-35区、核心间隔区、-10区)做改良工作。如周等人在枯草芽胞杆菌中，通过随机突变策略改造启动子PsrfA的核心间隔区，获得的最佳突变启动子PBH4较原始启动子PsrfA，使GFP的表达水平提高了2倍(DOI:10.1186/s12934-019-1148-3)，又如严等人在枯草芽胞杆菌中，通过对启动子PylB的-35区和-10区进行突变，获得的最佳突变启动子PNBP3510较原始启动子PylB，使β-半乳糖苷酶(BgaB)活性提高近25倍(DOI:10.1186/s12934-019-1159-0)，以及王等人对T7启动子核心区(-35区和-10区)进行组合，得到的最佳启动子P21285提高了L-天冬酰胺酶和酸性脲酶在大肠杆菌中的产量(DOI:10.1002/biot.201800298)。

地衣芽胞杆菌是一个重要的工业生产模式菌株，具有分泌蛋白能力强特征，且被美国FDA认定为生物安全性菌株，从而其可作为蛋白和目标代谢物生产的优良宿主。目前，其已经实现多种蛋白和代谢物高效生产，如α-淀粉酶、碱性蛋白酶，杆菌肽等。然而，地衣芽胞杆菌在表达多数外源蛋白时，存在表达难或表达效率低的问题，而启动子被认定为是建立基因高效表达工具的主要表达元件，且启动子改造是开发能优化蛋白表达水平和代谢物代谢途径技术的首选策略。在地衣芽胞杆菌中，启动子主要包括σ^A型和σ^B型启动子，其中σ^A型启动子主要介导与细胞生长和代谢相关基因的表达，而σ^B型启动子主要介导细胞响应内外各种压力(温度、渗透压、pH等)相关基因的表达。

发明内容

本发明的目的是提供了适用于地衣芽胞杆菌的启动子，所述的启动子序列为SEQID NO.2-SEQ ID NO.5中的任意一个。

适用于地衣芽胞杆菌的启动子在高效表达目的蛋白中的应用，将本发明的启动子导入地衣芽胞杆菌中，可提高地衣芽胞杆菌生产目的蛋白的能力。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

适用于地衣芽胞杆菌的启动子，所述的启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；或SEQ ID NO.3所示；或SEQ ID NO.4所示；或SEQ ID NO.5所示。

适用于地衣芽胞杆菌的启动子在提高地衣芽胞杆菌目的蛋白表达量中的应用，将本发明提供的启动子，导入地衣芽胞杆菌中，可提高蛋白表达和代谢产物的产量；将所述的启动子启动外源蛋白的表达可提高蛋白表达量，将所述的启动子启动增强代谢产物产量的基因表达，可提高代谢产物的产量。

以上所述的应用中，优选的，所述外源蛋白为绿色荧光蛋白和角蛋白酶；

以上所述的应用中，优选的，所述代谢产物为γ-PGA和杆菌肽；