[发明专利]一种动脉粥样硬化防治药物筛选细胞模型及其构建和应用有效
| 申请号： | 202010825420.9 | 申请日： | 2020-08-17 |
| 公开（公告）号： | CN111893090B | 公开（公告）日： | 2023-10-27 |
| 发明（设计）人： | 孙黔云;李娇 | 申请（专利权）人： | 贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室（贵州医科大学天然产物化学重点实验室） |
| 主分类号： | C12N5/077 | 分类号： | C12N5/077;C12Q1/02 |
| 代理公司： | 北京君泊知识产权代理有限公司 11496 | 代理人： | 王程远 |
| 地址： | 550014 贵州省贵阳市高新*** | 国省代码： | 贵州;52 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 动脉粥样硬化 防治 药物 筛选 细胞 模型 及其 构建 应用 | ||
1.一种动脉粥样硬化防治药物筛选细胞模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，制备眼镜蛇毒因子CVF；
步骤2，将制得的眼镜蛇毒因子CVF用生理盐水稀释后与NHP等体积混匀，于恒温水浴一段时候后得到补体旁路途径激活产物CAC；
步骤3，细胞培养：将人血管平滑肌细胞株VSMC用含15％FBS的DMEM高糖培养基，于37℃、含5％CO2细胞培养箱中培养；
步骤4，将步骤3所培养的对数生长期的人血管平滑肌细胞VSMC稀释后接种，一段时间后进行换液处理，加入步骤2所得的补体旁路途径激活产物CAC，反应一段时间后即得到所述用于筛选动脉粥样硬化防治药物的细胞模型。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2中所述眼镜蛇毒因子CVF稀释后的浓度为6.5×104U·L-1。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤4中所述补体旁路途径激活产物CAC与所述人血管平滑肌细胞VSMC稀释后的用量比为30～50μL/孔：100μL/孔。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤4中所述人血管平滑肌细胞液稀释后的浓度为7.5×104个/mL。
5.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述眼镜蛇毒因子是通过以下方法得到的：
将眼镜蛇的蛇毒冻干粉通过SP Sephadex C-25阳离子交换层析，收集活性峰，再经Sephacryl S-200分子筛凝胶层析，收集活性峰,经HiTrap Q HP柱阴离子交换层析，得到CVF的纯化制备产物，该纯化制备产物在非还原条件下的SDS-PAGE电泳中为一条带，还原条件下的条带特征符合CVF的特征，抗补体活力单位为1500U/mg，制备产物经BCA法蛋白定量后分装，冻存于-80℃备用。
6.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤4中加入步骤2所得的补体旁路途径激活产物后的反应时间至少为6h。
7.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤2中37℃恒温水浴0.5h。
8.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述换液处理是使用无血清DMEM培养基进行的。
9.一种基于权利要求1-8任意一项所述的构建方法构建得到的细胞模型，其特征在于，所述细胞模型为VSMC增殖活化模型。
10.一种如权利要求9所述的细胞模型在筛选动脉粥样硬化防治药物中的应用，其特征在于，所述药物是通过以下步骤进行筛选的：
将待测药物样品加入所述细胞模型中培养一段时间后，以细胞活力、黏附分子ICAM-1、VCAM-1作为筛选指标，以E-selectin为检测指标，检测后与未加待测药物样品的CAC模型组进行比较，数据下降的差异具有显著性(P＜0.05)，则可判定该样品对VSMC的增殖、VSMC的活化及炎症反应有抑制作用，即该样品具有作为动脉粥样硬化防治药物的潜力；否则不具有作为动脉粥样硬化防治药物的潜力。
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