[发明专利]基于核磁共振氢谱的LSD1的活性检测方法及其应用

说明书

本发明提供了基于核磁共振氢谱的LSD1的活性检测方法及其应用，方法包括：在反应缓冲液中加入LSD1、FAD和赖氨酸甲基化的组蛋白以及H₂O，进行去甲基化反应；利用核磁共振光谱仪对反应后体系进行检测，得到核磁共振谱图；根据所述核磁共振谱图，计算得到LSD1组蛋白赖氨酸去甲基化酶的活性值。本发明基于¹H‑NMR的检测方法可以准确反映出抑制剂对LSD1酶活性的干扰作用，因此可以有效应用于抑制剂筛选的研究中。且本发明在LSD1催化反应结束后不需要任何的样品制备步骤，可以在核磁共振管中完成催化反应和随后的¹H‑NMR检测，因此可以使用样品自动更换器高效获得多个样品的¹H‑NMR谱图。

技术领域

本发明涉及酶活性检测技术领域，尤其涉及基于核磁共振氢谱的LSD1的活性检测方法及其应用。

背景技术

组蛋白赖氨酸甲基化是一种重要的表观遗传调控方式，它对基因表达的调控十分重要。细胞内的组蛋白赖氨酸甲基化是一种可逆的修饰，分别由组蛋白赖氨酸甲基化转移酶和去甲基化酶催化发生甲基化修饰和去甲基化修饰。组蛋白赖氨酸残基存在一甲基化(me1)、二甲基化(me2)和三甲基化(me3)三种不同甲基化状态。

目前已经鉴定出20多种组蛋白赖氨酸去甲基化酶。LSD1(Lysine-specificdemethylase 1)是第一个被鉴定出的组蛋白赖氨酸去甲基化酶，属于胺氧化酶家族，负责催化H3K4me1/2的去甲基化。众多研究表明，LSD1在肺癌、乳腺癌、肝癌、结直肠癌和血液病中高表达。在肺癌、膀胱癌细胞中降低LSD1的表达可以抑制肿瘤细胞的增殖。神经母细胞瘤中LSD1与NMYC相互作用，共同抑制抑癌基因丛生蛋白(Clusterin，CLU)的表达。胎瘤、胚胎癌和精原细胞瘤等生殖细胞肿瘤中LSD1的表达也显著提高。这些研究表明LSD1在肿瘤的发生中有重要作用，是肿瘤治疗的潜在靶标。LSD1特异抑制剂的筛选对于LSD1功能研究和肿瘤治疗研究有着重要意义。

LSD1通过黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)依赖的氧化反应移除组蛋白H3K4me1/2的甲基，辅助因子FAD转化为还原形式的FADH2，然后被氧化为过氧化氢，最终生成甲醛和胺。目前已经有多种高通量筛选(high-throughput screening，HTS)方法平台应用于LSD1酶活性的检测及其抑制剂的筛选，包括抗体分析(antibody-based assays)、酶联分析(coupled enzyme-based assays)和质谱分析(massspectrometry-based assays)等。基于抗体的检测方法虽然具有高灵敏度的特性，但其易淬灭的特点会对准确性造成影响，额外的洗脱步骤会增加检测所用的时间，并且需要大量的肽段底物。质谱分析能直接检测去甲基化反应的底物，灵敏度较高，但需要优化样品，去除额外的成分，且当研究酶活性的时间依赖性时需要分别收集不同时间的样品。利用去甲基化反应副产物的酶联反应来间接检测LSD1催化的酶促反应的方法，如用甲醛脱氢酶(Formaldehyde dehydrogenase，FDH)将副产物甲醛氧化为甲酸，同时NAD+被还原为NADH，然后利用酶标仪测NADH在340nm处的吸收光，这种方法需要考虑偶联酶促反应带来的假阳性或假阴性的干扰。由于以上三种方法都存在相应的局限性，故需要建立更简便和准确的方法来直接测定LSD1的催化产物，并评估其酶活性。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于核磁共振氢谱的LSD1的活性检测方法及其应用，旨在解决现有检测方法操作复杂、准确性较低的问题。

本发明的技术方案如下：

一种LSD1组蛋白赖氨酸去甲基化酶的活性检测方法，其中，包括：

在反应缓冲液中加入LSD1组蛋白赖氨酸去甲基化酶、FAD和赖氨酸甲基化的组蛋白以及H₂O，进行去甲基化反应；