[发明专利]一种脱细胞人源角膜基质的制备方法

权利要求书

1.一种脱细胞人源角膜基质的制备方法，其特征在于：包括步骤如下：

1）脱细胞前处理：将来源于全飞秒激光屈光矫正手术的人角膜基质材料置于配制好的洗涤液中清洗，进行脱细胞前处理；

2）细胞破碎处理：采用渗透压冲击法使人角膜基质材料上残留细胞的细胞膜和核膜破裂，释放出其含有的DNA和RNA成分；

3）酶消化处理：采用DNA酶和RNA酶的联合作用，去除细胞破裂释放的DNA及RNA成分；

4）漂洗与修复：采用配制好的修复液对人角膜基质材料进行漂洗，清除破碎细胞的残留组织同时修复人角膜基质材料的创口；

5）灭菌：采用钴-60或电子束辐照对人角膜基质材料进行灭菌处理，从而完成制备，获得脱细胞人源角膜基质。

2.根据权利要求1所述的脱细胞人源角膜基质的制备方法，其特征在于：步骤1）中，所述脱细胞前处理，人角膜基质材料于洗涤液中清洗的次数为2～3次；冲洗时间为每次1～3min。

3.根据权利要求2所述的脱细胞人源角膜基质的制备方法，其特征在于：所述洗涤液为含1％体积分数的青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液的PBS或HBSS缓冲液。

4.根据权利要求1所述的脱细胞人源角膜基质的制备方法，其特征在于：步骤2）中，所述渗透压冲击法为高渗液-低渗液冲击法，即将人角膜基质材料先置于高渗液中，浸泡2～6h，待细胞内外渗透压达到平衡后移入低渗液中浸泡3～5h，使细胞快速溶胀，细胞膜和核膜破裂。

5.根据权利要求4所述的脱细胞人源角膜基质的制备方法，其特征在于：所述高渗液为1.5mol/L的NaCl溶液；所述低渗液为三蒸水。

6.根据权利要求1所述的脱细胞人源角膜基质的制备方法，其特征在于：步骤3）中，所述酶消化处理为使用含有DNA酶和RNA酶的PBS或HBSS缓冲液进行处理，处理的温度为25～35℃，处理时间为1h。

7.根据权利要求6所述的脱细胞人源角膜基质的制备方法，其特征在于：所述缓冲液中DNA酶和RNA酶的浓度均为500～1000U/ml。

8.根据权利要求1所述的脱细胞人源角膜基质的制备方法，其特征在于：步骤4）中，所述漂洗与修复，漂洗的次数为2～3次，漂洗时间为每次2～5h。

9.根据权利要求8所述的脱细胞人源角膜基质的制备方法，其特征在于：所述漂洗修复所用修复液的溶剂为三蒸水，修复液的组分中含有0.8～2%（重量）的透明质酸、1.0～2.5%（重量）的硫酸软骨素和0.5～2.5%（重量）的低分子量右旋糖酐。

10.根据权利要求1所述的脱细胞人源角膜基质的制备方法，其特征在于：步骤5）中，所述灭菌，采用钴-60或电子束辐照的剂量为15～25kGy。