[发明专利]利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得SCD1基因编辑山羊胚胎的方法在审
| 申请号： | 202010814808.9 | 申请日： | 2020-08-13 |
| 公开（公告）号： | CN111893119A | 公开（公告）日： | 2020-11-06 |
| 发明（设计）人： | 田慧彬;牛慧敏;罗军;姚玮玮;李聪;耿亚楠;雷安民;史怀平 | 申请（专利权）人： | 西北农林科技大学 |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/89;A61D19/04;A01K67/027 |
| 代理公司： | 西安通大专利代理有限责任公司 61200 | 代理人： | 范巍 |
| 地址： | 712100 陕*** | 国省代码： | 陕西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 利用 crispr cas9 系统 显微 注射 获得 scd1 基因 编辑 山羊 胚胎 方法 | ||
1.一种利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)通过体外转录获得CRISPR/Cas9系统，该系统包括Cas9 mRNA以及用于打靶山羊SCD1基因的sgRNA；所述sgRNA识别的靶序列分别位于山羊SCD1基因翻译起始部分及功能域部分的序列中；
2)将所述CRISPR/Cas9系统注射入供体山羊的原核期受精卵中，将经过注射的原核期受精卵移植入受体山羊体内或置于培养基内并继续发育，得到SCD1基因编辑山羊胚胎。
2.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，其特征在于：所述sgRNA识别的靶序列位于山羊SCD1基因第一外显子及第三外显子区。
3.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，其特征在于：所述sgRNA识别的靶序列为：
5’-GGCCCACTTGCTGCAAGAGG-3’
及
5’-GGACCCCTGCTGTGATGCCC-3’。
4.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，其特征在于：所述步骤2)中，对发情母羊最后一次接受交配后8-12小时或发情开始后46-50小时收集的受精卵进行体外注射。
5.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，其特征在于：所述显微注射的注射参数设置为：注射压强pi为150-400hPa，注射时间t为0.1-0.3s，维持压强pc为30-50hPa。
6.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的方法，其特征在于：所述显微注射采用的显微注射针利用拉针仪拉制而成，拉制参数设置为：heat＝786-846，pull＝90-110，velocity＝140-160，time＝190-210。
7.一种利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于打靶山羊SCD1基因的sgRNA；所述sgRNA识别的靶序列分别位于山羊SCD1基因翻译起始部分及功能域部分的序列中。
8.一种利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括sgRNA体外转录模板，所述体外转录模板含有用于打靶山羊SCD1基因的sgRNA的编码序列；所述sgRNA识别的靶序列分别位于山羊SCD1基因翻译起始部分及功能域部分的序列中。
9.一种利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得山羊基因编辑胚胎的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括sgRNA体外转录模板克隆载体，所述克隆载体中的sgRNA体外转录模板含有用于打靶山羊SCD1基因的sgRNA的编码序列；所述sgRNA识别的靶序列分别位于山羊SCD1基因翻译起始部分及功能域部分的序列中。
10.一种用于共打靶山羊SCD1基因的sgRNA，其特征在于：所述sgRNA识别的靶序列选自以下序列中的一个或两个：
5’-GGCCCACTTGCTGCAAGAGG-3’
5’-GGACCCCTGCTGTGATGCCC-3’。
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