[发明专利]用于H1和H3亚型猪流感病毒检测与分型的荧光定量RT-PCR引物、探针及试剂盒

权利要求书

1.一种用于H1和H3亚型猪流感病毒检测与分型的双重荧光定量RT-PCR的引物和探针，其特征在于包括两对特异性引物和探针，所述引物及探针序列如下：

(1)检测H1亚型猪流感病毒的引物及探针：

H1-上游引物:GGCTAYCATGCBAACAATTC

H1-下游引物:TGGGTTGCCMAGGATCCA

H1-探针：FAM-ACAGACACTGTMGACACA-MGB

(2)检测H3亚型猪流感病毒的引物及探针：

H3-上游引物:GAAATGGGAAAAGCTCAATAATGA

H3-下游引物：ATTTCTCATYCCTGTTGCCAA

H3-探针：HEX-CCAAATGGAAGCATT-MGB。

2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述检测H1亚型猪流感病毒的探针5’端使用FAM荧光基团标记，3‘端使用猝灭基团MGB标记；检测H3亚型猪流感病毒的探针5‘端使用HEX荧光基团标记，3’端使用猝灭基团MGB标记。

3.权利要求1或2所述的引物和探针在制备用于检测H1和H3亚型猪流感病毒的制品中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的制品为荧光定量检测试剂盒。

5.一种荧光定量检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含有权利要求1或者2所述的引物和探针。

6.一种用于H1和H3亚型猪流感病毒检测与分型的双重荧光定量RT-PCR方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)配制一步法荧光定量RT-PCR反应体系

反应液每管20μL，含有2×One Step U+Mix 10μL，One Step U+Enzyme Mix 1μL，50×ROX Reference Dye 1或50×ROX Reference Dye 2 0.4μL，10μmol/μL权利要求1所述引物各0.8μL，探针各0.4μL，RNase Free ddH20 2.6μL，待检样品RNA 2μL；

2)荧光定量RT-PCR反应体系扩增步骤设置

将检测反应步骤设置成：第一阶段反转录：55℃15min；第二阶段预变性：95℃30s；第三阶段：95℃10s，60℃35s并收集荧光信号，共40个循环；

3)结果判定

阳性判定标准需同时满足Ct值低于38和扩增曲线为“S”型两个条件；

阴性判定标准需要阴性对照无Ct值且无扩增曲线出现；

若Ct值在38至40区间，视为可疑，需要重复实验鉴定。