[发明专利]冠突散囊菌孢子多糖组分的制备方法

说明书

本发明提供一种冠突散囊菌孢子多糖组分的制备方法，其包括下述步骤：将冠突散囊菌孢子破壁后进行干燥，研磨成粉末，按每1g菌丝加30‑50mL的水并混匀，于80℃‑100℃水提1‑4小时，然后抽滤取上清；对于所得的上清，加5‑10倍体积的95％的乙醇醇沉24‑48小时，于4‑8℃过滤沉淀后，在3000r/min条件下离心10min，弃上清液，取沉淀，得到冠突粗多糖；对于所得的冠突粗多糖，按每100mg冠突粗多糖加蒸馏水3‑5mL溶解，10000‑12000rpm离心10min，将上清液上样于C18色谱柱进行分离纯化，按保留时间由短至长依次收集冠突孢子多糖‑1、2、3、4。

技术领域

本发明涉及生物工艺学，具体涉及一种冠突散囊菌孢子多糖组分的制备方法，该冠突散囊菌孢子多糖组分可用于制备预防和/或治疗肝癌的药物。

背景技术

有研究报道，冠突散囊菌分泌多糖是一种很好的免疫调节剂，能够有效地激活免疫细胞，调节机体的免疫功能，同时也发现多糖具有抗肿瘤活性，以及降血脂、抗氧化的功效。冠突散囊菌子囊孢子有一层较厚的孢子壁，其质地坚韧、不易分解，对孢子在干燥环境下的休眠具有积极意义，但另一方面也阻碍了人体对其中物质的有效利用。探寻一种高效、对活性成分影响小的冠突散囊菌孢子活性成分提取方法，是研究冠突散囊菌子囊孢子的各种活性成分的功能并加以利用的重要前提。

发明内容

发明人经过深入研究，开发了一种冠突散囊菌孢子多糖活性组分的制备方法，并发现通过该方法制备得到的冠突散囊菌孢子多糖组分(冠突孢子多糖-4)具有下述功能：

a.体外实验表明，冠突孢子多糖-4明显抑制高转移人肝癌细胞株HepG2的增殖，有时间依赖关系。

b.体外实验表明，冠突孢子多糖-4对WB-F344细胞体外恶性转化有抑制作用。

c.体外实验表明，冠突孢子多糖-4对TPA诱导WB-F344细胞间隙连接通讯(GJIC)抑制效应有阻断作用。

d.体外实验表明，冠突孢子多糖-4可明显降低转化细胞的恶性程度。

e.体内实验表明，冠突孢子多糖-4具有保护大鼠肝脏，以免其受到化学诱变剂的损伤的功效。

因此，本发明包括：

1.一种冠突散囊菌孢子多糖组分的制备方法，其包括下述步骤：

步骤A：将冠突散囊菌孢子破壁后进行干燥，研磨成粉末，按每1g菌丝加30-50mL的水并混匀，于80℃-100℃水提1-4小时，然后抽滤取上清；

步骤B：对于步骤A所得的上清，加5-10倍(优选8倍)体积的95％的乙醇醇沉24-48小时，于4-8℃过滤沉淀后，在3000rpm条件下离心10min，弃上清液，取沉淀，得到冠突粗多糖；

步骤C：对于步骤B所得的冠突粗多糖，按每100mg冠突粗多糖加蒸馏水3-5mL溶解，10000-12000rpm离心10min，将上清液上样于C18色谱柱进行分离纯化，按保留时间由短至长依次收集冠突孢子多糖-1，冠突孢子多糖-2，冠突孢子多糖-3和冠突孢子多糖-4，其中冠突孢子多糖-4即为所制备的冠突散囊菌孢子多糖组分。

2.根据项1所述的制备方法，其中，所述步骤C中的C18色谱柱为ZORBXA EclipseXDB-C₁₈(250mm×4.6mm，5μm，安捷伦公司产品)。

3.根据项1或2所述的制备方法，其中，所述步骤C中的所述C18色谱柱进行分离纯化的条件为流速：1.0mL/min，进样体积：20μL，柱温：25℃。

4.根据项1～3中任一项所述的制备方法，其中，所述步骤C中收集的冠突孢子多糖-1的保留时间为3.712分钟，冠突孢子多糖-2的保留时间为4.887分钟，冠突孢子多糖-3的保留时间为7.352分钟，冠突孢子多糖-4的保留时间为12.178分钟。