[发明专利]甲胎蛋白特异性结合多肽及应用

说明书

本发明涉及针对甲胎蛋白(alpha‑fetal protein，AFP)特异性结合多肽及其应用，属于生物技术领域。其中，所述多肽由葡萄球菌蛋白A(SPA)免疫球蛋白结合区域通过突变1‑20个氨基酸残基获得(多肽序列见SEQ ID：2‑14)，能够特异性结合甲胎蛋白。本发明通过三轮富集从全合成亲合体多肽分子库淘选获得甲胎蛋白特异性结合多肽编码序列，并利用原核表达系统对获得的多肽进行了大量制备，该多肽与甲胎蛋白特异结合，与CEA、EGF、BSA、胰岛素等蛋白无明显亲和，且相比于单克隆抗体具有制备成本低、稳定性好等显著优点。本发明还进一步应用该多肽及其变体作为酶联免疫检测中的捕获元件，用于甲胎蛋白定量检测，检测灵敏度分别为8和2ng，检测线性范围分别为10‑100ng和6‑100ng，可满足临床检测需求。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及特异性结合甲胎蛋白(alpha-fetalprotein，AFP)的多肽、或其变体、或其功能性片段，以及所述多肽、或其变体、或功能性片段的制备方法和应用。

背景技术

甲胎蛋白是由干细胞内粗面内质网核糖颗粒合成的一种糖蛋白，由一条含有591个氨基酸残基的单肽链组成(Bergstrand CG，Czar B et al.Demonstration of a newprotein fraction in serum from the human fetus.Scandinavian Journal ofClinicalLaboratory Investigation，1956，8(2)：174-174)。在胚胎发育过程中，甲胎蛋白是由胎儿肝脏和卵黄囊产生的，胚胎甲胎蛋白的浓度在第15周达到高峰，约为3mg/mL，然后慢慢降低，直到出生前，降为20μg/mL，而正常成人甲胎蛋白浓度小于25ng/mL。大量研究证明甲胎蛋白是原发性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)重要的血清学标志物，并作为PHC诊断、评价疗效给予后的敏感指标应用于临床(Kamiyama T，Takahashi M etal.AFP mRNA detected in bone marrow by real-time quantitative RT-PCR analysispredicts survival and recurrence after curative hepatectomy forhepatocellular carcinoma.Annals of Surgery，2006，244(3)：451)。另外，甲胎蛋白对于监测睾丸肿瘤发展及活动同样具有重要意义，在睾丸非精原细胞瘤的诊断和治疗效果评价中是较为敏感的指标。甲胎蛋白对于胃癌的早期发现和手术方式选择以及预后判断也具有较高的指导意义(宋玉环，汪运山，胡安拉：AFP阳性胃癌的研究进展.中华肿瘤防治杂志，2006，13(7)：552-555)。

目前国内对于甲胎蛋白的检测主要是用以下方法：胶体金免疫层析实验(GICA)(Zhao Y，Zhang G et al.Development of a lateral flow colloidal goldimmunoassay strip for the rapid detection of enrofloxacin residues.Journal ofAgriculturalFood Chemistry，2008，56(24)：12138-12142)、酶免疫法(ELSIA)(黄彩云，韩素桂，张景华，王晓蕊，李世龙，周秀艳：ELISA法检测甲胎蛋白异质体用于肝癌诊断的探讨.标记免疫分析与临床，2012，19(3)：147-149)、放射免疫法(RIA)、化学发光免疫法(CLISA)(黄延平：电化学发光免疫分析(ECLIA)检测甲胎蛋白(AFP)对原发性肝癌的临床诊断价值.中国民康医学，2010，22(9)：1127-1127)，其中化学发光法在国内外市场上广泛推广。以上几种免疫检测方法都需要利用特异性抗体，但由于抗体分子本身的特性，如属于二价多结构域蛋白、依赖二硫键连接、复杂的糖基化反应模式等，导致了抗体分子热稳定性差、制备过程复杂且昂贵等问题，因此，吝需开发新型甲胎蛋白亲和元件解决以上问题。