[发明专利]一种小鼠肝脏类器官模型及其建立方法和应用

说明书

本发明提供一种小鼠肝脏类器官模型及其建立方法和应用，该建立方法包括以下步骤：取小鼠肝脏组织，依次进行清洗、剪切、消化及过滤处理，获得小鼠肝脏干细胞；将小鼠肝脏干细胞依次进行原代培养、增殖培养和分化培养，既得。采用上述方法获得的肝脏类器官模型应用在药理学、药效学和毒理学分析中。本发明中肝脏类器官模型建立方法与常规方法相比，一方面大大缩短了培养周期：从取材到模型的获得，时间周期约为14～20天，而常规的培养方法耗时30天，明显提高了模型应用的可行性。另一方面，本发明方法明显提高了小鼠肝脏类器官培养的成功率并加快原代培养中类器官的生长速度。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种小鼠肝脏类器官模型及其建立方法和应用。

背景技术

药物性肝毒性是目前新药最关键的安全性指标，永生化肝细胞系和动物模型目前仍是药物代谢和毒性测试的“金标准”，但它们的实用性和长期培养能力十分有限，很大地限制了研究的广度和深度。基于动物模型的肝脏毒理实验，成本高，实验周期长，无法进行快速高通量检测分析。在肝毒性研究和临床前药物开发中，迫切需要能够开展高通量分析的体外模型来进行药物功效和毒性试验。小鼠是常用药物安全性评价模型，建立小鼠肝脏体外类器官研究模型，部分替代动物实验，能够极大提高基础研究和新药开发的效率。

发明内容

本发明旨在提供一种小鼠肝脏类器官模型及其建立方法和应用以解决上述问题。类器官(Organoid)是一种利用干细胞在体外3D条件下制备，能够模拟原生器官结构和功能的一类三维“微器官模型”。由于与对应的人类器官拥有高度相似的组织学特征，并能重现该器官的生理功能，类器官可作为多种疾病的体外模型，在干细胞与发育、再生医学、疾病研究、药物开发和肿瘤治疗等多个领域具有广泛的应用前景。相比传统的二维培养模型，类器官代表着一种能够概括整个生物体生理过程的创新技术，具有更接近生理细胞组成和行为、更稳定的基因组。本发明的目的是直接从成体组织中获得肝脏类器官，同时富集更多动物肝组织，比如小鼠中干细胞富集区的胆管样结构。在此模型的建立过程中，不仅省略了从诱导多能干细胞向终末分化细胞的发育过程，使得操作更为简便，成本更低，耗时更短，而且利用成体干细胞建立的肝脏类器官模型包括一个自我更新干细胞群，可分化为与来源器官特异性的细胞类型，是一个生理高度相关系统，相对于现有的细胞系模型和动物模型建立方法，更加具有应用价值。本发明的技术方案为：

第一个方面，本发明提供一种小鼠肝脏类器官模型的建立方法，包括以下步骤：取小鼠肝脏组织，依次进行清洗、剪切、消化及过滤处理，获得小鼠肝脏干细胞；将小鼠肝脏干细胞依次进行原代培养、增殖培养和分化培养，既得。

在一些实施例中，所述清洗处理包括：采用含1％双抗的生理盐水反复数次，直至剔除明显的脂肪组织。

在一些实施例中，所述消化处理包括：①将剪切好的组织分散在生理盐水中，离心去上清后往沉淀中加入胶原酶、分散酶与DNaseI，于37℃震荡消化 30min，加入含1％双抗的生理盐水终止消化，静置，收集细胞沉淀；②继续往细胞沉淀内加入胶原酶、分散酶与DNaseI，于37℃震荡消化30min，加入含1％双抗的生理盐水终止消化，静置沉淀，分别收集上清和细胞沉淀；③继续往细胞沉淀内加入胶原酶、分散酶与DNaseI，于37℃震荡消化30min，加入含1％双抗的生理盐水终止消化，静置沉淀，收集上清并与步骤②的上清合并。

在一些实施例中，所述过滤处理包括：将消化处理获得的消化液经100μm 的滤网过滤，收集滤液；将收集的滤液经40μm的滤网过滤，收集滤渣。

在一些实施例中，所述原代培养包括：将过滤处理获得的肝脏干细胞加入Advanced DMEM/F12培养基重悬，然后加入Matrigel胶混合均匀，待混合胶体凝固后加入原代提取培养基，于37℃、5％CO₂浓度下培养5～10天，期间每间隔3～4天更换一次培养基。