[发明专利]聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体、制备方法及其应用

说明书

一种聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体、制备方法及聚乙二醇化单修饰前后的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体在制备抗氧化药物、化妆品和保健品方面的应用，属于生物技术领域。本发明以重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体作为待修饰蛋白，以活化的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯作为修饰剂，通过共价偶联得到聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体，其分子量约为重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体的2倍，这有利于降低肾清除率，延长体内循环半衰期。修饰后表现出的较长半衰期、增强的药效以及较强的抗氧化活性，极大地拓宽了重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体的应用范围。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及聚乙二醇修饰蛋白质类化合物，特别是涉及一种聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体、制备方法及聚乙二醇化单修饰前后的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体在制备抗氧化药物、化妆品和保健品方面的应用。

背景技术

谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是生物体内一类非常重要的抗氧化酶系，属于大分子蛋白质类，在清除因物理或者化学因素造成的体内异常增多的自由基方面发挥着不可替代的作用。谷胱甘肽过氧化物酶GPX4是一种以单体形式存在的含硒蛋白，催化活性中心为硒代半胱氨酸。作为GPX家族的一员，谷胱甘肽过氧化物酶GPX4通过作用于磷脂氢过氧化物，能够减少复杂的脂质氢过氧化物与膜的结合，在维持脂质膜结构稳定中至关重要。天然谷胱甘肽过氧化物酶GPX4的来源有限，性质不稳定，为了解决这个问题，中国专利201410159032.6公开了新型高活力谷胱甘肽过氧化物酶GPX突变体及其制备方法，该制备方法通过基因突变或者合成手段，最后获得了产量高、稳定性强且酶活力高的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体，较强的抗氧化活性使其在制备抗氧化药物、化妆品及保健品方面具有广阔的应用前景。但是重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体在生物体内容易经肾清除而造成体内循环半衰期较短，从而减弱抗氧化效果，为解决上述问题，使得重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体可以得到更好的应用，我们需要对重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体进行修饰或者改造，以达到降低肾清除率，提高生物稳定性并尽可能保持生物活性的目的。

中国专利201110122788.X公开了一种修饰性谷胱甘肽过氧化物酶及其制备方法，该制备方法以猪谷胱甘肽过氧化物酶作为待修饰蛋白，以活化的直链单甲氧基聚乙二醇作为修饰剂，对该酶进行共价偶联。以直链单甲氧基聚乙二醇上游离的氯原子和该酶的氨基进行反应，氨基修饰率控制在40～45％，酶活力保持较高，但是修饰率不高。中国专利201810823075.8公开了一种聚乙二醇修饰的重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX1突变体的制备方法，该方法以重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX1突变体作为待修饰蛋白，以分子量为5kD的直链单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯作为修饰剂进行共价偶联，得到以稳定酰胺键存在的聚乙二醇化重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX1突变体，但是该方法制备得到的是多修饰产物和单修饰产物的混合物质。目前还没有专利公布关于重组谷胱甘肽过氧化物酶 GPX4突变体的聚乙二醇修饰工艺。在此背景下，通过聚乙二醇单修饰提高重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体的稳定性及延长重组谷胱甘肽过氧化物酶 GPX4突变体在体内的循环半衰期的研究具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的主要是重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体因在体内的稳定性差、肾清除率高而导致的循环半衰期短，从而无法在体内充分发挥作用的问题。

为解决上述问题，本发明的第一个目的是提供一种聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体。

本发明的第二个目的是提供上述聚乙二醇化单修饰重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体的制备方法。

本发明的第三个目的是提供上述聚乙二醇单修饰前后的该重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX4突变体在制备抗氧化药物、化妆品和保健品方面的应用。