[发明专利]一种耐低温高效农作物腐解菌液及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种耐低温高效农作物腐解菌液，其特征在于，所述菌液中含有如下腐解菌：

假单胞菌（Pseudomonas sp.）PS3-1、该菌株于2019年12月18日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC No.2020037；

假单胞菌（Pseudomonas sp.）SC6-1、该菌株于2019年12月18日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC No.2020038；

不动杆菌（Acinetobacter sp.）PS1-1、该菌株于2019年12月18日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC No.2020036；

所述菌剂中有效活菌数≥1×10⁹cfu/mL；。

2.根据权利要求1所述的一种耐低温高效农作物腐解菌液，其特征在于，所述菌液中还含有戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），所述戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus）、该菌株于2019年12月18日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC No.20191062。

3.根据权利要求1所述的一种耐低温高效农作物腐解菌液，其特征在于，所述液体菌剂中还包含有哈茨木霉（Trichoderma harzianum Rifai）、皮壳正青霉（Eupenicillium crustaceum），所述哈茨木霉和皮壳正青霉购买于北京北纳创联生物技术研究院，所述哈茨木霉的保藏编号为BNCC336568、所述皮壳正青霉的保藏编号为BNCC146720。

4.一种耐低温高效农作物腐解菌液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 ：

步骤1，富集驯化

按无菌操作取土壤菌悬液接入富集培养基中，以农作物秸秆粉作为唯一碳源，振荡条件下进行富集驯化和传代培养，所述传代培养中每代降低5 ℃的温度梯度，按体积分数5%（V/V）接种量进行富集和驯化耐低温且高效降解秸秆的菌种；

步骤2，筛选分离

将步骤1中的富集培养液按梯度法稀释得到稀释液，吸取所述稀释液涂布于刚果红纤维素钠平板上倒置培养，选取菌落直径和水解圈直径较大且形态不同的菌落编号，重复液体培养和固体平板划线分离，将获得的纯菌转接到LB斜面培养基上，4 ℃冰箱保存；

步骤3，扩大培养

首先将步骤2的纯菌斜面用无菌接种环刮取适培养物接种于LB液体培养基；

根据各株菌的生长速率调整接菌和培养时间，按10~20%（V/V）接种量转接于对应类型的液体培养基中，进行扩繁，以便在同一时间获得对数生长中后期浓度基本一致的菌液，扩大培养后的菌液依然按无菌操作，进行离心浓缩；

步骤4，混合发酵

将步骤3离心浓缩收集的菌体/孢子，用无菌水制成浓度一致的重悬，将混合菌液接种到液体发酵培养基中，按照体积比1:1进行混合，得到性质功能稳定、有效活菌数≥1×10⁹cfu/mL的复合微生物液体菌剂。

5.如权利要求 4所述的一种耐低温高效农作物腐解菌液的制备方法，其特征在于，菌种的筛选分离，将步骤1中的富集培养液按10倍梯度法稀释得到10^-3~10^-8稀释液，各吸取100 μL稀释液涂布于刚果红纤维素钠平板，于20~25 ℃温度下倒置培养，选取菌落直径和水解圈直径较大且形态不同的菌落编号，重复液体培养和固体平板划线分离，将获得的纯菌转接到LB斜面培养基上，4 ℃冰箱保存。