[发明专利]表皮干细胞向胰腺细胞分化的改进方法

说明书

本发明提供了一种表皮干细胞向胰腺细胞分化的改进方法，基于表皮干细胞作为基础，通过添加活性诱导肽，使得细胞分化成为胰腺细胞，并且分化时间较短，表皮干细胞来源宽泛，成本低廉，制备简便，具有极好的市场应用前景。

技术领域

本发明涉及非胚胎多能干细胞领域，具体地涉及非胚胎多能干细胞提供胰腺细胞的用途以及产生和使用它们的方法。

背景技术

胚胎干细胞是一种全能干细胞，在适当的条件下它可分化为体内任何组织的体细胞。Lumelsky等人报道，通过体外五步诱导的方法，可将胚胎干细胞诱导分化为胰岛β细胞，而Shi等在他们的研究中报道，他们通过三步法可将胚胎干细胞诱导成为胰岛β细胞，并且这些细胞移植入糖尿病老鼠体内后可使动物的体重增加，存活时间延长，血糖下降。但是，由于胚胎干细胞存在目前尚无法解决的致瘤性问题，因此目前离临床运用还有一定的距离。

对于胰腺腺管来源的干细胞，Bonner-Weir等在他们的研究报告中报道，在胰腺的腺管中存在一种CK19阳性的干细胞，此种细胞在有KGF和Matrigel存在的情况下，可大量扩增并分化为胰岛β细胞。对于胰岛来源的干细胞，Zulewski等报道，他们从正常胰腺的胰岛团中分离培养出了一种表达神经干细胞标志nestin蛋白(巢蛋白)的细胞，此种细胞可在体外大量扩增，并且可在exendin-4、activinA、HGF、Betacellulin和nicotiamide的作用下分化为胰腺内分泌细胞。

Huangamp；Tang，2003；Zulewski et al.，2001文章中披露的胰腺干细胞为胰岛来源的成体干细胞。Zulewski等所用的组织为正常的人或鼠的胰腺组织。由于在实践中难以获得足够数量的正常的人胰腺组织，所以将该技术应用于临床时仍会面临来源不足的问题。

在现有技术中，还有其他的方式来获得胰腺细胞。比如CN101310012A中提供将非胚胎多能干细胞向胰腺谱系分化的方法。本发明进一步提供非胚胎多能干细胞及其衍生的子代，从而为受试者提供胰腺细胞。所述方法包含将表达Ngn3的细胞与烟酰胺或exendiM两者中的一种或与这两者相接触以产生表达胰岛素的细胞，所述表达Ngn3的细胞已经通过下述过程制备：(1)将表达Oct-4和端粒酶且可以分化成外胚层、内胚层和中胚层细胞类型的非胚胎干、非生殖、非胚胎生殖细胞与一种第一试剂和一种第二试剂相接触以产生Pdx-I表达升高的细胞，其中所述第一试剂是激活素A，所述第二试剂抑制音猬因子(SHH)活性；以及(2)将Pdx-I表达升高的细胞与EGF和/或HGF相接触，以产生Ngn3表达升高的细胞。但是该方法制备复杂，成功率还有待进一步的提高。

CN1847394A中公开了一种诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法，该方法是依次利用Activin A和顺式视黄酸处理由胚胎干细胞形成的胚胎小体，使其分化得到胰腺细胞。但是该方法中使用了胚胎干细胞，由于胚胎干细胞来源有限，并不适应大规模推广使用，市场应用价值不高。

因此，需要解决胰岛移植中胰腺组织来源不足的问题，还需要寻找一种来源广泛的干细胞，并且采用简单诱导方式即可获得胰腺细胞来满足社会的需求，从而造福人类。

发明内容

本发明提供了与现有技术方案相比，将来源更为简便的表皮干细胞以更短的时间量(7天)和显著增加的产率(高达97％产率)分化成确定的胰腺细胞的改进方法。

本文提供了使表皮干细胞分化为的胰腺细胞的方法，该方法包括步骤：

第一步，将表皮干细胞放至1％Matrigel铺被的培养皿中按照如下方法用活性刺激肽诱导：