[发明专利]基于荧光素酶报告基因的生物活性检测试剂

说明书

本发明公开了基于荧光素酶报告基因的生物活性检测试剂，包括底物缓冲液与萤火虫荧光素酶底物；底物缓冲液包括两性离子缓冲剂、镁盐、巯基还原剂、生物缓冲剂、高能化合物、辅酶、非离子型表面活性剂、溶剂。本发明开发的这款报告基因检测试剂，同样包括底物缓冲液及配套底物，在灵敏度（发光强度)和光稳定性方面取得显著的进步，使其保持了相对的信号稳定，同时发光强度获得了较高的提升，使试剂的整体性能同时满足科研的基因表达调控研究和企业的新药开发，一方面可以应用于科研领域如评估响应元件如何控制基因表达等，另一方面可以应用于新药研发和生产中的药物作用机制、生物活性、效力和稳定性评估。

技术领域

本发明属于生物试剂，具体涉及基于荧光素酶报告基因的生物活性检测试剂。

背景技术

报告基因是一种易于测定的生物分析检测方法，报告基因的种类多样，如抗生素抗性蛋白、氯霉素乙酰基转移酶（CAT）、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、萤火虫荧光素酶等的编码基因。其中，萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）由luc基因编码，其蛋白分子量为61kDa，因萤火虫荧光素酶在宿主细胞中无背景萤光，无需翻译后修饰，酶测定的灵敏性和方便性以及蛋白质合成与酶活性的紧密耦合等特性，使其成为报告基因的理想选择。

萤火虫荧光素酶报告基因是以萤火虫荧光素（luciferin）为底物来检测萤火虫荧光素酶活性的一种报告系统。萤火虫荧光素在 ATP、镁离子和氧气存在的条件下，被萤火虫荧光素酶催化进行氧化脱羧反应，产生激活态的氧化荧光（Oxyluciferin），并产生生物萤光（ Bioluminescence），通过荧光测定仪或多功能酶标仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光（图1）。生物荧光与荧光素酶的启动子活性成比例，间接反映了细胞刺激物的生物学活性。

萤火虫荧光素酶报告基因检测是基因表达调节研究的重要手段，目前已被广泛应用于分子生物学及细胞生物学研究领域。转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。萤火虫荧光素酶报告基因是检测转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合及相互作用的重要手段。目前用于此类检测的产品以闪光型底物为主，往往发光强度高，但光稳定性差、淬灭率快，通常需要先对细胞进行裂解处理，再通过相应检测试剂和底物进行测试。

萤火虫报告基因检测也是一种将转录调控和报告基因偶联表达，通过报告基因表达产物活性判断细胞刺激物（如小分子化合物、重组蛋白） 生物学活性的方法。效应物激活其在细胞表面的结合位点后，通过报告基因表达产物活性测定信号通路变化的活性，基于对信号通路了解的基础上，将携带作用靶点反应元件与报告基因的质粒稳定转染细胞后，通过效应物与相应靶点的作用，启动报告基因的表达来检测效应物的生物学活性。例如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC）检测，传统ADCC检测方法非常复杂，需要从外周血中分离单核细胞，并经过多日培养分化得到巨噬细胞作为效应细胞。检测时需要对效应细胞及靶细胞进行免疫标记，通过流式细胞仪等手段探测效应细胞对靶细胞的吞噬作用。该方法变异性大、耗费人力、耗时长，不适合作为质量控制方法。相较于传统的ADCC检测法，以报告基因法检测的产品，主要以辉光型底物为主，加上一管集裂解和反应于一体的反应液，光稳定性好，但光强度一般。