[发明专利]基于高通量测序技术检测玉米叶部病原真菌的方法及应用

说明书

本发明公开了基于高通量测序技术检测玉米叶部病原真菌的方法及应用，属于玉米叶部病原真菌检测技术领域。具体方法如下：(1)取玉米植株叶片，富集叶部微生物，提取微生物总DNA；(2)PCR扩增真菌ITS序列，高通量测序；(3)将高通量测序结果根据97％阈值划分OTU，进行物种鉴定，统计玉米叶部病原真菌的种类和序列数量；(4)以每一属病原真菌序列在总序列中的比例作为属水平上的丰度，将丰度大于0.5％的列为高丰度病原真菌，小于0.5％的列为低丰度病原真菌；(5)病原真菌丰度与病害病情指数呈正相关，根据病原真菌丰度预测后期病害发生种类和程度。本发明方法检测准确，效率高，在玉米叶部病害防治中具有重要价值。

技术领域

本发明涉及玉米叶部病原真菌检测技术领域，更具体的说是涉及基于高通量测序技术检测玉米叶部病原真菌的方法及应用。

背景技术

近年来，随着全球变暖，玉米栽培制度变革(如免耕和秸秆还田)，使得土壤中玉米病原菌数量增加，玉米病害发生逐年加重；其中，玉米叶部病害会影响光合作用，导致叶片枯死，特别是玉米灌浆期发病会导致籽粒不饱满，严重影响玉米产量和品质。

玉米叶部病害种类较多，如玉米大斑病(Exserohilum turcicum)、玉米小斑病(Bipolaris maydis)、玉米锈病(Pucciniapolysora)、玉米弯孢叶斑病(Curvularialunata)、玉米灰斑病(Cercospora zeaemaydis)、玉米褐斑病(Physoderma maydis)等，均为真菌性病害。玉米大斑病是最为常见玉米叶部病害，严重时病斑融合，造成整个叶片枯死，可导致减产12-20％。玉米小斑病严重时多数病斑连在一起，造成叶片枯死，一般造成减产15-20％，严重时减产达50％以上。玉米锈病近年有危害加重的趋势，发病时间提前，叶片因病枯死，感病品种一般减产10％-20％。玉米弯孢叶斑病会造成叶片提早干枯，一般减产20％-30％，严重地块减产50％。玉米灰斑病是玉米产区普遍发生的叶部病害之一，引起的损失可导致减产5-10％。玉米褐斑病一般造成减产10％左右，严重时减产30％以上。在田间，多种玉米叶部病害可同时发生，如在一张叶片上发现玉米大、小斑、弯孢叶斑病、灰斑病、锈病和褐斑病，无疑会加大病害诊断和防治难度，因此，需要对玉米叶部病害进行早期诊断，以利于病害的有效防控。

培养法和显微镜检是常用的病原菌检测方法，然而培养法周期较长，不能及时有效获得检测结果；叶片表面存在大量微生物，而病原真菌数量较少，因此采用培养法很难有效分离出病原真菌。显微镜检必须依赖发病部位产生病原菌菌丝和孢子，需要病害发生到一定程度，显然不能满足病害早期诊断的要求。

随着分子生物学技术发展，半巢式多聚酶链反应(PCR)和环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplication,LAMP)应用于病原菌检测，通过设计病原菌的特异性引物，快速检测病原菌。然而，以特异性引物为基础的检测方法只能检测一种病原菌，不能做到同时检测多种病原菌。

因此，如何针对玉米叶部病原菌提供一种高效、快速、全面的早期检测方法成为本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明提供了基于高通量测序技术检测玉米叶部病原真菌的方法，其检测准确，效率高，在玉米叶部病害防治中具有重要价值。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

基于高通量测序技术检测玉米叶部病原真菌的方法，包括如下步骤：

(1)取玉米植株叶片，富集叶部微生物，提取微生物总DNA；

(2)以步骤(1)提取的微生物总DNA为模板，PCR扩增真菌ITS序列，然后采用Illumina的PE300平台进行高通量测序；

(3)将高通量测序结果根据97％阈值划分操作分类单元OTU，进行物种鉴定，统计玉米叶部病原真菌的种类和序列数量；