[发明专利]一种检测2019-nCov的CRISPR试剂及其用途

说明书

本发明提供了一种检测2019‑nCov的CRISPR试剂及其在制备检测2019‑nCov的试剂盒中的用途，所述CRISPR试剂包括RPA扩增引物对及对应的crRNA。本发明基于CRISPR分子诊断技术，通过RPA‑CRISPR的偶联，能够实现“序列扩增”(RPA完成)加上“酶促级联”(Cas酶完成)的两级放大，从而在简单仪器(金属浴)条件下，高灵敏度、高特异性的对2019‑nCov进行检测。

技术领域

本发明涉及医学诊断领域，特别是涉及一种检测2019-nCov的CRISPR试剂及其在制备检测2019-nCov的试剂盒中的用途等。

背景技术

冠状病毒是一个大型RNA病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。2019新型冠状病毒(2019-nCov)，2020年2月11日被国际病毒分类委员会命名为SARS-CoV-2，可以导致2019新型冠状病毒病(COVID-2019)，该病毒从2019新型冠状病毒病的患者中被分离、确认，是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，简称为新型冠状病毒(nCov)。人感染了2019新型冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭等，甚至死亡。目前对于2019新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法，而其传染性比流感、SARS却要高很多，所以对2019新型冠状病毒的尽早诊断对治疗与防控有重要意义。

目前国家药品监督管理局共批准2019新型冠状病毒核酸检测试剂11个，抗体检测试剂8个。病毒抗体检测试剂检测的样本是血清，目标产物是机体对病毒产生的抗体，但是抗体一般在患者恢复期才大量产生，时效性差，无法作为病毒感染的早期诊断，对传染性极高的新型冠状病毒的诊断和防控毫无意义。但是病毒核酸检测要求的敏感性和特异性很高。核酸检测可检测呼吸道标本(鼻拭子、咽拭子、鼻咽或气管抽取物、痰)中的流感病毒核酸，且可区分流感病毒亚型。而现有技术中，核酸检测试剂盒通常为荧光定量PCR检测与测序检测方法。然而，这些技术仍具有诸多不足之处：1.PCR技术需要精确的温度系统控制，在一些不发达地区无法实现；2.检测灵敏度和特异性仍需进一步提高；3.PCR技术只能用于DNA片段检测，RNA片段需要提前加入一步逆转录的过程，操作复杂，而且开管操作容易造成样品污染。可见，这些检测方法对实验仪器，检测人员，检测场所有限制，因此一种检测方便快速的2019新型冠状病毒检测试剂在目前疫情情况下显得尤为重要。

聚合酶扩增(RPA)是一种快速兴起的恒温扩增技术，通过能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和具有链置换功能的DNA聚合酶，在恒定温度下即可获得可检测级别的扩增核酸。但是，原理上其单级扩增反应的本质并未改变，相较于目前市场上多数的实时定量PCR(QPCR)检测方式，其并没有实质性的灵敏度提升。

Cas蛋白是来源于古菌和细菌的利用CRISPR-Cas系统抵御外源DNA浸染的蛋白，包括Cas9，Cpf1，C2c1，C2c2(Cas13a)等，它们都是由向导RNA介导的切割目标DNA的DNA核酸内切酶。Cas9和Cpf1已成功开发为重要的基因编辑工具，它们可作为开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的巧妙工具。Cas13a是VI型CRISPR-Cas系统效应蛋白，具有RNA介导的RNA酶切活性，是目前第二大类CRISPR-Cas系统发现的唯一能够降解RNA的蛋白。Cas13a蛋白在crRNA的引导下，靶向目标序列后可启动其自身的“附带切割”活性，如果同时在体系中加入BIOTIN与FAM标记的RNA报告分子,正常情况下完整的报告分子不会被检测到，当寡核苷酸分子被水解后，游离的报告分子可以被检测到。但目前并未将该技术应用到对2019-nCov的检测。

发明内容

本发明发现，基于CRISPR分子诊断技术，通过RPA-CRISPR的偶联，能够实现“序列扩增”(RPA完成)加上“酶促级联”(Cas酶完成)的两级放大，从而在简单仪器(金属浴)条件下，高灵敏度、高特异性的对2019-nCov进行检测。因此，