[发明专利]一种用于检测HPV病毒和分型的微流控芯片

说明书

本发明提供了一种用于检测HPV病毒和分型的微流控芯片，利用高特异性的MGB探针法，在HPV病毒基因E６E７区域设计各型别的特异引物和探针，将引物和探针及可以冻干成粉末的酶预混液包埋于微流控芯片内，获得的微流控芯片进行检测HPV病毒，操作简单，成本较低，周期短，克服了目前基于通用引物HPV病毒检测出现假阳性和假阳性，效率低，分型不准确以及不全面的问题。

技术领域

本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种用于检测HPV病毒和分型的微流控芯片。

背景技术

人乳头瘤病毒（Human Paillomavirus,HPV），属于乳头瘤病毒科，是一种小分子的、无被膜包被的、环状双链DNA病毒，含有约7900 对碱基(bp)，共有3 个基因区组成，包括早期区(Early Region，E 区)、晚期区(Late Region，L 区) 区和与非编码区(UncodingRegion，UCR) 或上游调控区(URR)。E 区按顺序为E6、E7、E1、E2、E3、E4 和E5 共7 个基因，参与病毒DNA 的复制、转录、编码病毒蛋白、维持细胞内病毒的高拷贝数的基因，其中E6 和E7 是HPV 的主要致癌基因，与病毒细胞转化功能及致癌性有关。HPV 通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。该病毒不但具有宿主特异性，而且具有组织特异性，只能感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，引起人类皮肤的多种乳头状瘤或疣及生殖道上皮增生性损伤。

全球范围的研究结果显示，70%～80%的女性在其一生中会有至少一次的HPV 感染，在99.7%的宫颈癌患者体内检测到高危型HPV DNA 的存在，其中HPV16 型、18 型、45 型和31 型感染占80%。低危型HPV 一般与尖锐湿疣或低度鳞状上皮内病变相关，极少引起浸润癌。因此HPV检测对HPV病毒的检测和分型显得极为重要。关于高危型与低危型的划分，国际上许多机构都给出了参考建议，依据WHO 国际癌症研究机构（IARC）及其他国际组织的研究成果，将HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68 等13 种基因型列为高危型别，26、53、66、73、82 等5 种基因型列为中等风险型别。

在传统的宫颈癌的诊断主要遵循“三阶梯式”诊断程序，即宫颈细胞学、阴道镜及组织病理学检查。传统的女性宫颈癌早期筛查主要是依靠这种“三阶梯式”诊断程序，在用三种检测方法时，在宫颈细胞取样过程中容易使得病变细胞脱离，制片过程也极易使得细胞形态发生变化或者被其它炎症细胞和血细胞覆盖，同时结果判定太依靠于个人主观判定，因此很容易发生疾病漏诊。当然现在也出现了一些现代分子检测技术，如DNA杂交检测技术、Q-PCR荧光染料检测技术等，DNA杂交技术虽然检测结果特异高，但是检测成本和检测过程复杂，极容易使得检测过程出现差错，产生假阴性结果；Q-PCR荧光染料检测技术虽然成本低，但是具有一个显著的缺点，即其特异性非常容易受到非特异性基因扩增和引物二聚体形成的影响，这使得双链DNA 结合荧光染料qPCR 方法一直无法能够有效地应用于临床检测。然而MGB探针法qPCR 可以有效地解决双链DNA 结合荧光染料qPCR 非特异性问题，MGB探针法qPCR具有特异性极强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快等优点，可以在未来的临床检测和微流控芯片检测中成为分子诊断的重要工具。

同时本发明是运用于微流控芯片的HPV病毒检测和分型，微流控芯片操作简便、价格低廉、样品用量少、分析速度快且不依赖昂贵仪器，非常适合于经济不发达地区对疾病的快速检测和分析。该芯片可以扩展到其它任意病原体的快速检测，对于某些急性传染性病原体的基层防控具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测HPV病毒和分型的微流控芯片，具体涉及一种基于微流控芯片的含高危和低危20种型别HPV病毒检测和分型的方法。采用具有稳定性强、特异性高等特点的MGB探针法，通过保守性高且不易发生丢失的E６、E７区域设计的型特异性引物，结合一种自主研发的可以冻干成粉末包埋于微流控芯片内的Q-PCR引物和探针以及酶预混液，最终实现通过微流控芯片进行检测HPV病毒，操作简单，成本较低，周期短。