[发明专利]一种用于冻干的QPCR反应缓冲液

说明书

本发明提供一种用于冻干的QPCR反应缓冲液，包括如下原料：三羟甲基氨基甲烷‑盐酸缓冲液700‑800mM、硫酸铵150‑250mM、吐温‑20 0.05‑0.15% V/V、氯化镁30‑35mM、海藻糖5‑15mg/ml、甲酰胺5‑15wt.%。本发明将荧光PCR需要用到的所有组分制备在同一冻干粉末中，能够实现不需要过度依赖低温保存；使用时只需用冻干粉溶解液溶解该冻干粉，然后加入样本即可。具有使用方便、稳定可靠的特点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于冻干的QPCR反应缓冲液。

背景技术

人乳头瘤病毒（Human Paillomavirus,HPV），属于乳头瘤病毒科，是一种小分子的、无被膜包被的、环状双链DNA病毒，含有约7900 对碱基(bp)，共有3 个基因区组成，包括早期区(Early Region，E 区)、晚期区(Late Region，L 区) 区和与非编码区(UncodingRegion，UCR) 或上游调控区(URR)。E 区按顺序为E6、E7、E1、E2、E3、E4 和E5 共7 个基因，参与病毒DNA 的复制、转录、编码病毒蛋白、维持细胞内病毒的高拷贝数的基因，其中E6 和E7 是HPV 的主要致癌基因，与病毒细胞转化功能及致癌性有关。HPV 通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。该病毒不但具有宿主特异性，而且具有组织特异性，只能感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，引起人类皮肤的多种乳头状瘤或疣及生殖道上皮增生性损伤。

近年来随着生物快检行业的不断发展，实时荧光PCR技术检测方法简单快捷、灵敏高特异强，进而被广泛应用于临床诊断、食品安全、法医学等领域。

实时荧光PCR技术检测的反应组分体系主要包括：荧光PCR反应缓冲系统、引物、探针、酶、dNTP。其中在这些组分中引物、探针、酶、dNTP为保证其功能活性需要在低温下保存。现阶段，荧光定量PCR类产品的组成方式通常为：反应缓冲液与酶单独分开的形式，使用时，必须先将反应缓冲液和酶按照一定比例混合均匀后，分装至PCR扩增管中，然后再加入样本。在临床使用过程中配制相对繁琐，配制误差较大，从而造成实验结果不稳定等不良结果出现。若将酶、dNTP、引物探针提前混合好，在液体状态下引物探针又会结合形成二聚体结构，从而影响扩增效果。

为了满足临床简单方便快捷的需求，亟需发明一种使用方便、且不需要过度依赖低温保存及运输的荧光PCR扩增试剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于冻干的QPCR反应缓冲液，该方法能够实现荧光定量PCR所有组分混合在同一管中，使得产品无需过度依赖低温保存运输。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于冻干的QPCR反应缓冲液，包括如下原料：三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液700-800mM、硫酸铵150-250mM、吐温-20 0.05-0.15% V/V、氯化镁30-35mM、海藻糖5-15mg/ml、甲酰胺5-15wt.%。

优选的，包括如下原料：pH 8.8三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液750mM、硫酸铵200mM、吐温-20 0.1% V/V、氯化镁32.5mM、海藻糖10mg/ml、甲酰胺10wt.%。

Tris-HCl缓冲液的浓度为0.05mol/L。

海藻糖，作为赋形剂能保证干粉状态，同时保持酶的活性结构；在海藻糖中加入甲酰胺，在保持酶活性写同时能避免引起引物二聚体的产生。

将上述QPCR反应缓冲液与相应的引物及探针（根据检测的内容不同加入不同的目标引物探针）混合液按照600μL/管分装到1.5mLPCR扩增管或者八联管中。将分装好的试剂放入冻干机中-80℃预冻4小时。将冻干机气压降到10Pa以下-35℃真空处理0.5小时。真空状态下将冻干机内部温度(冷肼温度)降至-45℃真空处理4小时。冻干完毕后，盖上扩增管或者八联管盖。制备好的荧光PCR冻干粉试剂常温避光保存。