[发明专利]一种测试ApoE4蛋白含量的ELISA试剂盒

说明书

本发明提供一种测试ApoE4蛋白含量的ELISA试剂盒，包括：包被含捕获抗体的固相载体、样品稀释液、标准品蛋白、酶标一抗pan ApoE、显色底物及终止液；其中，所述捕获抗体为抗APOE4点突变单克隆抗体。本发明的有益效果相比：本发明所提供的双夹心单克隆抗体ELISA试剂盒能够特异性的识别APOE4点突变蛋白，其经过包被固相法合成的APOE4‑Arg、APOE4‑Cys表位肽和包被基因工程细胞所产的APOE4‑Arg和APOE4‑Cys蛋白两种筛选方式进行筛选，具有良好的灵敏性、特异性以及准确性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种测试ApoE4蛋白含量的ELISA试剂盒。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)，又名老年痴呆症，是一种年龄相关的神经退行性疾病，其主要临床表现为记忆功能障碍和行为方面的改变。作为一种进行性的疾病，AD最重要的生理特征是大脑部分区域经历进行性功能障碍、神经元损失和突触的丧失。Bateman等的研究证明，在AD发作前10至20年患者大脑就开始逐渐产生变化。而这些功能性的变化往往难以逆转，这也导致了目前AD治疗的困境。因此，对早期AD的检测可能是预防与治疗AD最有效的手段。

血液生物标记物的检测因其便宜、易于操作以及非侵入性的优势成为众多疾病检测的首选方式。而在AD中，众多蛋白被证明在AD患者血浆中有明显变化，如BDNF,AGT,IGFBP-2,OPN等，提示血浆蛋白质含量检测可能是AD早期诊断有价值的方式。

而载脂蛋白E(ApoE)被证明与AD发生相关。载脂蛋白(Apo)E基因分为三种等位基因型ε2、ε3、ε4，分别编码ApoE2、ApoE3和ApoE4三种异构体。三种不同亚型ApoE之间的区别仅在于其一级结构112与158位点的氨基酸不同，即ApoE2(112Cys,158Cys)、ApoE3(112Cys,158Arg)、ApoE4(112Arg,158Arg)。其中，ApoEε4基因高表达已被公认为是AD最大的危险因素之一。1990年Duke大学对占发病大部分的散发性AD(SAD)和迟发家族性AD(FAD)做免疫组化分析发现:老年斑和神经纤维缠结中存在ApoE4。研究证明,散发性和家族性晚发AD均与ε4有关。临床发现杂合子ε4携带者患晚发AD的机率比非携带者高3倍、纯合子ε4携带者患AD的机率比非携带者高10-20倍。carwfodr等发现ε4基因与患者年龄、发病年龄有相关性。而在早期诊断中，若个体携带ApoE4,则给AD的诊断增加至少5％～10％的置信度,尤其对于不同痴呆类型的鉴别诊断。同时若患者具备AD相关行为表型，且携带ApoE4,则诊断AD的准确性可达94％～98％。这些均提示：ApoE4基因型的检测可能是早期AD诊断最有价值的指标之一。

但是，目前国内外对ApoE基因型的检测主要通过第二代高通量测序系统，成本高昂的同时，准确性亦难得到保证。据2015年底全国性肿瘤二代测序实验室质量评估报告结果显示，55％的实验室测序结果不合格，22％的实验室质量评估为0分。这些导致ApoE4基因型检测在AD诊断中难以被推广使用。

而基因型的变化会导致蛋白表达的变化。据文献报道,ApoE等位基因的差异可引起AD患者血清抑ApoE浓度发生变化,并使AD患者血脂代谢发生异常；AD患者血清ApoE4浓度较正常人显著升高。提示检测血清中ApoE4蛋白的含量可能在早期AD诊断中具有非常重要的意义。而目前国内外并未有ApoE4蛋白检测试剂盒面市。与此同时，蛋白质试剂盒检测具备准确度高、成本低廉的优势。因此，研究者认为血清ApoE4蛋白检测试剂盒的研发能为早期AD诊断提供有力的证据，具备一定的现实意义及经济效益。

单克隆抗体技术在疾病诊断、药物开发中的应用是目前医药领域的一个研究热点，也为多种疾病的治疗提供了新的途径。

目前，用以检测的ApoE4单克隆抗体无法完全区分ApoE2与ApoE3类型，因此ApoE4单克隆抗体对ApoE4检测的特异性不强，进一步也导致无法开发出特异性强的ApoE4试剂检测产品。

发明内容