[发明专利]一种RAW 264.7细胞炎症模型的建立方法

权利要求书

1.一种RAW 264.7细胞炎症模型的建立方法，其特征在于：采用革兰氏阴性菌鼠伤寒沙门氏菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌匀浆提取物诱导RAW 264.7细胞炎症反应。

2.根据权利要求1所述的RAW 264.7细胞炎症模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌分别接种于250ml LB培养基培养过夜，分别对菌体进行6000rpm离心分离并用预冷PBS洗涤2-3遍，然后分别对菌体进行冰浴超声破碎，鼠伤寒沙门氏菌超声条件100-200w，10s/20s，10-30min，金黄色葡萄球菌超声条件100-200w，10s/20s，20-40min，将细菌匀浆于4℃，12000rpm离心10min，获取上清并用0.22μm的针孔滤器过滤；

(2)将处于对数期生长的RAW 264.7细胞重悬于细胞培养基，然后将细胞按每孔5000个细胞接种于96孔板中，培养过夜后吸去培养基，然后分别加入含有不同浓度和不同配比的细菌匀浆提取物，其中配比按照金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌匀浆提取物体积比(1:0-0:1)进行配置，浓度分别为1.25-10μl/ml，每个浓度设5个重复孔，同时设置阴性对照和空白对照。培养24h后加入20μl MTT(5mg/ml)，继续培养4h，最后每孔加入100μl DMSO后用酶标仪在550nm波长下测定吸光度；

(3)将处于对数期生长的RAW264.7巨噬细胞以5×10⁴个细胞每孔接种于96孔板，置于5％CO2培养箱，培养过夜后吸去培养基，然后分别加入含有不同浓度和不同配比的细菌匀浆，其中配比按照金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌匀浆提取物体积比(1:0-0:1)进行配置，浓度分别为1.25-10μl/ml，每个浓度设3个重复孔，同时设置阴性对照和LPS组(0.01-10μg/ml)。培养3-24h后收集上清，测定NO的浓度。

3.根据权利要求1或2所述RAW 264.7细胞炎症模型的建立方法，其特征在于，所述的细菌为革兰氏阴性菌鼠伤寒沙门氏菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌。

4.根据权利要求1或2所述RAW 264.7细胞炎症模型的建立方法，其特征在于，所述的细菌为革兰氏阴性菌鼠伤寒沙门氏菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的超声破碎条件分别是100-200w，10s/20s，10-30min和100-200w，10s/20s，20-40min。

5.根据权利要求1或2所述RAW 264.7细胞炎症模型的建立方法，其特征在于，所述将细菌匀浆于的离心条件是4℃，12000rpm，10min。

6.根据权利要求1或2所述RAW 264.7细胞炎症模型的建立方法，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌匀浆提取物体积比分别为1:0、1:0.25、1:0.5、1:1、1:2、1:4和0:1，浓度分别为1.25μl/ml、2.5μl/ml、5μl/ml和10μl/ml。

7.根据权利要求1或2所述RAW 264.7细胞炎症模型的建立方法，其特征在于，所述细菌匀浆提取物和LPS对细胞作用时间分别为3、6、12和24h。

8.权利要求1或2所述RAW 264.7细胞炎症模型的建立方法在抗炎症药物筛选和机制研究中的应用。