[发明专利]一种以SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD区为抗原的纳米疫苗及其制备

权利要求书

1.一种以SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD区为抗原的纳米疫苗，其特征在于：该疫苗是一种表达SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD区氨基酸序列的蛋白，其单体氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示，在细胞内24个单体能自组装成球体结构，并且融合表达的SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD肽段展示在球体表面。

2.制备权利要求1所述纳米疫苗的方法，具体包括以下步骤：

(1)将带有SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD区基因序列的表达载体转染进293T、293i、CHO细胞系中进行抗体表达，所述的SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD区基因序列如序列表SEQ ID NO.2所示；其中，293T细胞表达体系使用无血清培养基，转染试剂为FuGENE HD Transfection(Promega)；293i和CHO细胞表达体系为悬浮表达系统，使用无血清培养基，转染试剂为PEI25000；其余操作按照293T、293i和CHO细胞表达体系的常规操作方法进行；

(2)使用非变性提取方法包括研磨、冻融和超声方法提取细胞中蛋白；培养基直接超滤富集；

(3)Ni-NTA柱进行抗体的亲和层析纯化，并收集纯化后的蛋白；其中，洗脱时使用梯度洗脱方法，基础缓冲液组成为50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，0.05％吐温20和5％甘油，pH7.5；洗脱缓冲液由基础缓冲液加入不同浓度的咪唑配制；梯度洗脱方法为使用10mM，20mM和40mM咪唑的洗脱缓冲液依次洗脱至无蛋白流出，然后依次使用200mM和300mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱，并收集200mM和300mM咪唑的洗脱缓冲液，富集收集的200mM和300mM咪唑的洗脱缓冲液；

(4)纯化后的蛋白使用pH 7.5的2mM PBS进行过夜透析，透析后蛋白检测浓度备用；

(5)将目的蛋白总量与终浓度为1mg/ml的氢氧化铝佐剂混合孵育2h以上，形成稳定的混合物即为所需的纳米自组装颗粒蛋白疫苗。