[发明专利]一种单增李斯特菌核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种单增李斯特菌核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用，属于微生物检测领域，该参考样品采用包含来源于不同单增李斯特菌菌株的hlyA、plcB和inlA基因的片段插入质粒中形成，各基因以1:1比例串联，基因间以不相关的基因片段进行隔开；本参考品包含明确的hlyA、plcB、inlA三种检测基因，序列来源清晰，而且均按照单拷贝方式保存于质粒中，不仅可以用于定性检测，还可以作为量值可溯源的参考品进行试剂性能鉴定和实验室之间能力评价。

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，特别是涉及一种单增李斯特菌核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用。

背景技术

单核细胞增生李斯特氏菌(L Monocytogenes)简称单增李斯特菌，归属于李斯特菌属(Listeria)，在世界范围内被公认为是一种重要的人兽共患食源性致病菌。单增李斯特菌具有较强的致病性，主要会导致单核细胞增多、败血症、脑膜炎、孕妇流产及死胎等临床表现。单增李斯特菌在4℃的低温环境中依旧具有较强的生长繁殖能力，日常生活中在冰箱中冷冻保存许久的食物极易被单增李斯特菌污染。单增李斯特菌容易通过肉乳制品引起人的感染发病，因此世界多国相关卫生部门已经逐步重视起对单增李斯特菌的防控。

目前用于实验室及检测机构的单增李斯特菌的检测方法主要有两种。第一种是传统的依赖于生化与形态学特点的培养及其改进方法，其特点是：检验周期较长，实验操作较为复杂，结果准确性差，容易出现假阴性检测结果。第二种是聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction，PCR)方法，包括普通的PCR方法和实时荧光定量PCR方法。PCR方法原理是利用单增李斯特菌区别于李斯特菌属内其他细菌的多个靶基因选择特异性序列建立PCR以及实时荧光PCR。此种方法具有快速、灵敏、特异的特点，已经成为食源性病原微生物的有效的检测手段。但是作为PCR检测方法相应的核酸参考品目前十分缺乏。基因组DNA作为参考品，难以同时为多个靶标提供可溯源的定量参考。小片段核酸则无法在多种检测试剂和方法之间提供可参比的参考性。因此新型的可对多种检测靶标量值溯源核酸参考材料对于李斯特菌的核酸检测的发展至关重要。

质粒DNA标准品(pDNA)是一种新兴的生物标准品，具有纯度高，稳定性好，研制成本低的特点。依靠发达的合成平台，可以容易地从生物技术公司设计和制备各种长度的双链DNA片段，并应用于制备新的质粒DNA标准样品。它不仅可以用作核酸检测的定性阳性对照，还可以通过构建定量分析的标准曲线后用作定量标准。因此质粒DNA标准品在核酸检测的可追溯性过程中也可起到关键作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种单增李斯特菌核酸检测质粒DNA参考样品、制备方法及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明拟通过合成含有单增李斯特菌检测的hlyA、plcB、inlA基因的质粒作为qPCR参考品，并就其均匀性、稳定性等性能进行评价，探讨其替代传统基因组参考品的可行性，以期这种可追溯有效的参考材料可以解决病原核酸检测能力快速发展与缺乏参考材料之间的矛盾。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种单增李斯特菌核酸检测质粒DNA参考样品，采用包含来源于不同单增李斯特菌菌株的hlyA、plcB和inlA全长基因的片段插入质粒中形成；

所述单增李斯特菌核酸检测质粒DNA参考样品的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述hlyA、plcB和inlA基因以等比例串联；

所述hlyA、plcB和inlA基因间以不相关的基因片段进行隔开。

进一步地，在260nm和280nm处的光密度值比值在1.8-2.0之间。

进一步地，所述不相关的基因片段的核苷酸序列为aagtcg。

本发明还提供一种上述的单增李斯特菌核酸检测质粒DNA参考样品的制备方法，包括：