[发明专利]改良ATMT构建基因过表达哈茨木霉菌株在褐煤降解中的应用

说明书

本发明公开了一种改良ATMT构建基因过表达哈茨木霉菌株在褐煤降解中的应用，内容包括基因过表达载体的构建、ATMT转化以及高表达胞外酶哈次木霉在褐煤降解中的应用。pkd7‑HYG原始质粒T‑DNA区域含有TrpC启动子—潮霉素抗性—TrpC终止子功能元件和组蛋白启动子—RFP基因—组蛋白终止子功能元件，克隆出需要进行表达的基因替换掉RFP基因，构建重组质粒；通过改良ATMT将T‑DNA区域插入到哈次木霉AH基因组DNA中，获得转化子，对转化子进行验证、筛选，进而进行褐煤降解验证即可。本发明主要从构建基因过表达哈次木霉菌株，以获得对于褐煤降解能力更强的菌株。本发明构建得到过表达菌株相应基因的表达量远远高于野生株。并且菌株经过继代培养后，其基因高表达能够稳定遗传，为研究更多种类基因过表达菌株在褐煤降解中的应用提供方法。

技术领域

本发明设计基因工程领域，具体涉及一种通过改良的农杆菌介导的ATMT转化方法得到基因过表达哈茨木霉菌株在褐煤降解中的应用。

背景技术

风化煤、褐煤等低阶煤资源，在我国已探明的储量就达到数千亿吨,占全国煤炭储量的近三分之一。其中褐煤是一种变质程度低、易风化自燃、发热量低、含水量、含氧量及挥发分较高的年轻煤种，芳香族碳含量较低，并含有少量的氮和硫等元素。这些低价煤资源直接燃烧热效率低,工业应用价值低，长期露天堆放，不仅造成能源的浪费，而且容易造成环境污染。因此，如何合理开发和充分利用褐煤及低阶煤资源将是一个值得深入研究的课题。

煤炭作为资源，具有广泛的用途，既可以作为能源，又可以提取有用的化工产品，60%以上的化工原料就来自煤炭，对经济的发展起着重要的作用。作为能源，煤炭必须清洁高效利用，采用高温、高压等手段把煤转变为液体、气体等其它类燃料代替油类物质，就是其高效转化利用的一种。而从煤炭中提取化工产品,通常采用的是物理的、化学的外加一定的压力一定的温度的条件下来进行。从煤炭转化为油类物质和提取化工品的过程来看，成本较高、条件苛刻。而采用微生物转化技术来处理煤炭，使之转化成另一种产品，或者作为燃料，或者从中提取化工品，或作为其它类物质，具有工艺简单、低能耗、无污染等许多常规处理技术难以比拟的优点。因此，微生物转化技术处理煤炭已成为了国内外研究的热点。利用白腐真菌，放线菌等进行低阶煤液化降解的报道、研究较多，但是利用哈茨木霉特别基因过表达哈茨木霉菌株进行低阶煤降解的研究还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改良ATMT构建基因过表达哈茨木霉菌在褐煤降解中的应用。通过改良后的ATMT介导的遗传转化方法，构建基因过表达哈茨木霉AH菌株，获得的过表达菌株具有高表达相应基因蛋白的特性，能够提高菌株降解褐煤的能力。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

S1、将含有重组质粒的农杆菌接种到含有12.5g/ml利福平、100g/ml羧苄青霉素、50g/ml卡那霉素的LB固体培养基上，28 ^oC活化培养。将AH菌接种到产孢培养基中，28 ^oC、180rpm光照培养至开始产孢；AH菌开始产孢子后，将活化好的农杆菌，挑取单菌落接种到2×LB培养基中，28 ^oC、180 rpm 培养1 d；

S2、4500 rpm离心收集农杆菌菌体，利用IM培养基悬浮含有重组质粒的农杆菌菌体，利用IM培养基调节OD600至0.35-0.4之间，28^oC 180rpm培养6h；

S3、6h后取等体积AGL-1菌液与哈茨木霉AH菌IM培养基孢子悬液，构成混液，均匀涂布在表面铺有硝酸纤维膜的CM培养基上，于28 ^oC避光共培养48h～60h；

S4、待菌丝铺满硝酸纤维膜表面时，将硝酸纤维膜转移至所述SM培养基，28 ^oC避光培养3d，待长出较小转化子即可；