[发明专利]一种用于生物矿化口蹄疫病毒样颗粒的磷酸钙材料以及制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种矿化口蹄疫病毒样颗粒，是由病毒样颗粒和颗粒表面覆盖的矿化外壳构成，所述的口蹄疫病毒样颗粒是由口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、结构蛋白VP1和结构蛋白VP3组装而成，然后通过矿化液矿化处理获得了表面覆盖的矿化外壳。矿化液是由含有钙离子和磷酸根离子的材料构成，其中钙离子和磷酸根离子的浓度比为1.33‑2.0，通过矿化处理在口蹄疫病毒样颗粒表面形成35‑50nm厚的矿化外壳。本发明矿化口蹄疫病毒样颗粒具有提高病毒样颗粒稳定性、进入细胞内的数量显著增加、诱导机体产生更多的特异性抗体和中和抗体。

技术领域

本发明涉及一种具有良好生物相容性的生物矿化材料制备以及方法与应用，尤其是磷酸钙制备方法以及在提高口蹄疫病毒样颗粒的耐热性、提高进入细胞的量和中和抗体水平上的应用。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是具有高度传染性和经济破坏性的家畜病毒病，被国际兽医局(OIE)列为必报的动物疫病首位，我国农业部将其列为“一类疫病之首”，而且其还被列为国际生物武器公约动物类传染病名单。因其传播途径广、传播速度快，因此一旦爆发疫情，将引起巨大的经济损失，因此口蹄疫的净化防控显得尤为重要。疫苗接种是防治口蹄疫的主要手段。

目前常用的疫苗除了传统灭活病毒外还有亚单位疫苗，病毒样颗粒逐渐成为新型疫苗中的佼佼者。

病毒样颗粒(VLPs)是一种结构、性质与活病毒粒子相似但不含病毒基因的空衣壳，这些衣壳含有的总蛋白和正常病毒粒子一样，因此被广泛用于DNA、siRNA、蛋白的递送及人用或兽用疫苗的开发，成为最有可能代替传统疫苗的有力候选者，目前乙肝、乳头状瘤病毒、及猪圆环等的病毒样颗粒疫苗已经获批上市。

病毒样颗粒疫苗的生产不需要动用活病毒，且生产成本低，能够容易的区分感染和免疫动物，但是病毒样颗粒疫苗的热稳定性仍然较差，需要用冷链进行储存和运输。

近年来，通过基因工程技术和蛋白质工程技术，开发了具有自矿化能力的病毒颗粒疫苗，即在病毒颗粒表面引入具有诱导无机物矿化能力的多肽，从而获得了核-壳结构的热稳定疫苗，其表面带有无机物外壳，疫苗以及多肽被无机物外壳所包被，无机物外壳对疫苗有保护作用，使疫苗能在常温或高温环境下保持活性(见王光川等的公开专利CN104096235A)。进一步，在该文献中披露了所用的无机物主要是指阳离子成分是Ca²⁺离子的矿物，含钙矿物可以是磷酸钙、碳酸钙、草酸钙等。

本发明人课题组集中在口蹄疫病毒颗粒方面的研究已有数十年，在矿化口蹄疫病毒颗粒的制备(CN107475207)专利文献中，我们利用口蹄疫VLPs大肠杆菌表达组装技术平台，通过基因工程手段，将三种能有效富集钙离子的矿化肽分别插入到O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的loop环中，在大肠杆菌中成功表达并组装完整的VLPs，且对组装效率并未造成影响。具体的通过基因工程手段首先获得的口蹄疫病毒颗粒是由口蹄疫病毒的结构蛋白VP0、嵌合矿化肽的结构蛋白VP1以及结构蛋白VP3组装而成，然后通过矿化剂矿化处理获得了表面覆盖有磷酸钙外壳的矿化口蹄疫病毒样颗粒。所用的矿化剂是包含Na⁺、k⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-、HCO^3-、HPO4^2-、PO4^3-的矿化液。

随着研究的深入，我们对矿化处理的工艺进一步精选，从而获取的口蹄疫病毒样颗粒的耐热性具有显著提升，同时口蹄疫病毒颗粒进入细胞的数量、以及所产生的特异性抗体和中和抗体的滴度都有显著增加。

发明内容

本发明一方面提供一种矿化口蹄疫病毒样颗粒，其表面覆盖有矿化外壳，本发明矿化口蹄疫病毒样颗粒具有提高的病毒样颗粒稳定性、进入细胞内的数量显著增加、诱导机体产生更多的特异性抗体和中和抗体。