[发明专利]一种可以在田间、常温操作的香蕉枯萎病菌热带4号小种可视化检测技术体系

说明书

本发明公开了一种可以在田间、常温操作的香蕉枯萎病菌热带4号小种可视化检测技术体系，公开了检测香蕉枯萎病菌Foc TR4的基因标记物基因FOIG_16627，Foc TR4/香蕉基因组DNA快速提取方法，以及结合PRA扩增和侧向流动试纸条，2‑3min内即可获知样品是否存有Foc TR4。本发明还公开了一种含有硅胶滤膜的抽提式的过滤吸附装置，通过利用硅胶膜对基因组DNA的吸附作用，可以在田间常温、不使用离心机的情况下对Foc TR4/香蕉基因组DNA快速提取，提取过程仅需要10min，快速方便，仪器设备要求不高。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种可以在田间、常温操作的香蕉枯萎病菌热带4号小种(Foc TR4)可视化检测技术体系，具体涉及一种Foc TR4鉴定的PCR特异性引物。

背景技术

香蕉枯萎病是国际植物检疫对象，Foc TR4是重点对象，其已对全球香蕉产业造成毁灭性威胁。Foc TR4最先在马来西亚、印度尼西亚暴发，已经传播至亚洲大部分香蕉种植国，其中我国也是Foc TR4危害最严重的国家，每年经济损失可以达到50亿元。2013年FocTR4传播至非洲的莫桑比克，直接威胁当地的主粮品种-煮食蕉。香蕉在非洲是主要粮食之一，Foc TR4的危害可能会断绝非洲人民的粮食来源。2019年Foc TR4又在南美洲的哥伦比亚暴发，引起中南美的香蕉种植国的极度恐慌，因为病菌将会毁灭当地的香蕉产业以及进出口贸易。

目前，有效防控Foc TR4的措施包括种植抗耐病新品种、植物检疫等。前者面临着病菌进化的威胁；病菌传播速度快，带菌蕉苗、土壤、农机具、水源等是主要媒介。另外，在不断发展的国际国内贸易，带菌香蕉果实可以轻易传送到世界各地。因此加强植物检疫，延缓Foc扩散是当前防控工作的重点。不过现在还比较缺乏快速、实用的Foc检测技术，限制了国际植物检疫措施标准的有效执行。

传统Foc鉴定方法(1)Race、VCG鉴别法；(2)常规PCR法等。传统方法的缺点为：病原菌的分离、单孢分离、接种试验、看家基因序列测定、突变体诱导和亲和试验等，耗时非常长、工作量大，技术高，田间操作的可行性非常小。

首先看家基因的扩增需要提取样品的基因组DNA，目前基因组DNA的提取方法如SDS法、CTAB法、尿素提取法及以硅胶滤膜为基质的离心柱吸附等。缺点在于：步骤繁琐，耗时比较长，对实验室的设备要求比较高，很难在田间实地、海关检测、条件落后的发展中国家应用。

其次缺乏稳定Foc TR4的鉴定标记，现有TR4标记均根据Foc看家基因的个别SNP标记设计的，容易受到PCR退火温度的影响，出现假阳性的几率比较高。

根据现今存在的问题，研发一种在田间、常温操作的香蕉枯萎病菌热带4号小种可视化检测技术体系，用以延缓Foc TR4扩散成为亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种香蕉枯萎病热带4号小种Foc TR4鉴定的PCR特异性引物。

本发明所采取的技术方案是：

本发明第一方面，提供了一种检测Foc TR4的基因标记物，所述基因标记物为FOIG_16557。

根据本发明的实施例，所述香蕉枯萎病菌为Foc TR4。

现有技术中，Foc TR4的分子标记均根据Foc看家基因上面的SNP变异位点设计的，特别依赖于扩增温度，当退火温度出现变化时，有时会出现非特异性的扩增。但是，本发明根据Foc TR4的特异致病功能基因FOIG_16557的序列，研发的Foc TR4特异的分子标记，该分子标记是特异的，不会因为扩增过程中退火温度的变化，出现非特异性的扩增。

本发明第二方面，提供了用于扩增前面所述基因标记物FOIG_16557的引物对，引物对核苷酸序列为：

F：5’-ATTAGTGGGTCGTGTCAAGAC-3’；