[发明专利]一种检测大豆线虫的引物和探针及方法

说明书

本发明公开了一种检测大豆线虫的引物和探针，包括如下核苷酸序列：(1)检测线虫病的PCR引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示；(2)检测胞囊线虫的探针：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；(3)检测结线虫的探针：其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。本发明还公开了利用核酸层析试纸检测大豆线虫的方法，不能发明具有特异性强、灵敏度高、操作简便等特点，生产所需的耗材、设备成本不高，可大规模推广使用。

技术领域

本发明属于植物病原菌检测技术领域，具体涉及一种检测大豆线虫的引物和探针及方法。

背景技术

大豆作为人类食物和动物饲料的主要来源，豆科植物在自然和农业生态系统中发挥着重要作用，并为工业生产提供大量基础原料。近年来，随着居民消费结构升级，大豆需求量高速增加，当前，中国已成为世界上最大的大豆消费国。为了应对复杂的国际贸易环境，我国积极振兴大豆产业，提高种植面积和单位面积产量，提升国产大豆自给能力。国家粮油信息中心预计，2019年我国大豆播种面积为1.3275亿亩，同比增长5.4％，其中黑龙江大豆播种面积为5730亿亩，同比增长7.0％。虽然正在扩大其种植规模，目前我国大豆的对外依存度依然超过80％。2019年1-3季度中国大豆进口量为6451万吨，是中国进口量最大的农产品。

随着种植面积和进口量的增长，检疫病害跨境传播的风险也在增加。线虫是大豆上的主要病害之一，包括胞囊线虫和根结线虫两大类，严重可导致减产70-80％，每年会造成约10亿美元的经济损失。其中，大豆胞囊线虫(Soybean cyst nematode)发病会感染植株明显矮化，生长瘦弱，叶片由下而上发黄，通常呈点片状，花期延迟，籽粒瘦小或不结荚，严重时会成片枯死。大豆根节线虫(Soybean Root-knot nematode)发病会使豆根受线虫刺激，形成节状瘤，病瘤大小不等，形状不一，有的小如米粒，有的形成“根结团”，表面粗糙，瘤内有线虫。病株矮小，叶片黄化，严重时植株萎蔫枯死，田间成片黄黄绿绿，参差不齐。为了控制线虫危害，国内外采取了包括物理、化学、生物、栽培措施在内的多种防治方法，而有效的检疫手段是线虫防治的关键。

目前的植物检疫手段主要有形态学检测、生化检测和分子生物学方法等(PCR-跑胶、ITS-PCR-RFLP、实时荧光定量PCR法等)。这些方法检测准确度高、低污染的特点，但是需要电泳、染色、成像等多个步骤，对检测耗时、费力，对设备依赖程度高，传统检测方法不能适应大面积作物现场检测或进口检疫场景下大规模筛查的需要。

免疫层析试纸条(Immunochromatography test strip，ICTS)是一种将生物化学交联、层析分析技术等技术方法有机集合在一起的固相标记免疫检测技术，是目前常用的快速检测方法之一。免疫层析试纸可结合PCR、多重PCR、等温扩增技术等多种核酸扩增技术，通过对扩增目的产物进行荧光素标记，利用相应的抗体来实现特异性检测。由于其操作简单、省时、制造成本低、对设备依赖程度较低，结果易判定的特点，非常合适用于大规模现场检测。

发明内容

发明目的：本发明要解决的技术问题是提供一种检测大豆线虫病的引物和探针。

本发明还要解决的技术问题是提供上述检测大豆线虫病的引物和探针在利用核酸层析试纸检测大豆线虫的中的应用，以提供一种具有高灵敏度和高特异性的检测方法，实现一步操作即可对目的片段进行快速、简便的可视化检测，并定位出感染的线虫种类。检测过程无需依赖复杂的仪器设备，特别适合即时检验和大面积普查等。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种检测大豆线虫病的引物和探针，包括如下核苷酸序列：

(1)检测线虫病的PCR引物：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示；

(2)检测胞囊线虫的探针：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；