[发明专利]牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗及其制备方法与所用悬浮MDBK细胞

权利要求书

1.牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于：包括：

1)用悬浮MDBK细胞培养牛传染性鼻气管炎病毒，得到牛传染性鼻气管炎病毒液，将所述牛传染性鼻气管炎病毒液进行灭活，得到灭活的牛传染性鼻气管炎病毒抗原液；用液体培养基培养牛支原体，得到牛支原体液，将所述牛支原体液进行灭活，得到灭活的牛支原体抗原液；

所述悬浮MDBK细胞按照包括如下步骤的方法制备：将贴壁MDBK细胞以低血清悬浮培养基传代培养，再以无血清悬浮培养基传代培养，获得的细胞即为悬浮MDBK细胞；所述以低血清悬浮培养基传代培养是用所述低血清悬浮培养基传代培养7代～15代，所述以无血清悬浮培养基传代培养是用所述无血清悬浮培养基传代25代～40代；

所述低血清悬浮培养基为向壹生科ST细胞全悬浮培养基中加入胎牛血清、青霉素和链霉素，得到的液体培养基；所述低血清悬浮培养基中胎牛血清的体积百分含量为3％，青霉素含量为100U/ml，链霉素含量为0.1mg/ml；

所述无血清悬浮培养基是向壹生科ST细胞全悬浮培养基中加入青霉素和链霉素，得到的液体培养基；该无血清悬浮培养基中，青霉素含量为100U/ml，链霉素含量为0.1mg/ml；

2)将所述灭活的牛传染性鼻气管炎病毒抗原液和所述灭活的牛支原体抗原液混合后作为活性成分，得到牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗；

所述以低血清悬浮培养基传代培养在震荡条件下进行；所述以无血清悬浮培养基传代培养在所述震荡条件下进行；

所述牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗中，牛支原体抗原含量以灭活前的牛支原体计，牛传染性鼻气管炎病毒抗原含量以灭活前的牛传染性鼻气管炎病毒计，所述二联苗中牛传染性鼻气管炎病毒抗原含量不低于0.5×10⁷TCID₅₀/ml，所述牛支原体抗原的含量不低于1×10⁸cfu/ml。

2.由权利要求1所述的方法制备得到的牛传染性鼻气管炎病毒与牛支原体二联灭活疫苗。

3.一种制备悬浮MDBK细胞的方法，其特征在于：包括将贴壁MDBK细胞以低血清悬浮培养基传代培养，再以无血清悬浮培养基传代培养，获得的细胞即为悬浮MDBK细胞；所述低血清悬浮培养基为向壹生科ST细胞全悬浮培养基中加入胎牛血清、青霉素和链霉素，得到的液体培养基；所述低血清悬浮培养基中胎牛血清的体积百分含量为3％，青霉素含量为100U/ml，链霉素含量为0.1mg/ml；所述无血清悬浮培养基是向壹生科ST细胞全悬浮培养基中加入青霉素和链霉素，得到的液体培养基；该无血清悬浮培养基中，青霉素含量为100U/ml，链霉素含量为0.1mg/ml；所述以低血清悬浮培养基传代培养是用所述低血清悬浮培养基传代培养7代～15代，所述培养在悬浮条件下进行；所述以无血清悬浮培养基传代培养是用所述无血清悬浮培养基传代25代～40代，所述培养在所述悬浮条件下进行。

4.由权利要求3所述的方法制备的悬浮MDBK细胞。

5.如下Y1-Y7中的任一种应用：

Y1、权利要求4所述的悬浮MDBK细胞在悬浮培养病毒抗原中的应用；

Y2、权利要求4所述的悬浮MDBK细胞在悬浮培养IBRV抗原中的应用；

Y3、权利要求4所述的悬浮MDBK细胞在制备疫苗中的应用；

Y4、权利要求4所述的悬浮MDBK细胞在制备含有IBRV抗原的疫苗中的应用；

Y5、权利要求4所述的悬浮MDBK细胞在制备IBRV与MB二联灭活疫苗中的应用。

6.悬浮培养IBRV病毒液的方法，其特征在于：其为以权利要求4所述的悬浮MDBK细胞悬浮培养IBRV，所述IBRV的接毒量为MOI＝0.1，接毒后72～96h收毒，得到IBRV病毒液。

7.由权利要求6所述的方法制备的IBRV病毒液。