[发明专利]具有变异衣壳蛋白的腺相关病毒及其应用

说明书

本发明公开了一种具有变异型衣壳蛋白的腺相关病毒及其应用，所述变异型腺相关病毒AAV9‑RB，即在野生型AAV9衣壳蛋白VP1的Q588与A589之间插入氨基酸序列LADQDYTKTA。变异型腺相关病毒AAV9‑RB为首次报道的既能从轴突末端高效逆行感染，也能穿过血脑屏障靶向大脑细胞的病毒体，可以为神经科学研究和脑疾病治疗提供了更好的技术支撑，具有广泛的应用价值和前景。

技术领域

本发明属于腺相关病毒技术领域，具体涉及一种具有变异衣壳蛋白的腺相关病毒及其应用。

背景技术

病毒载体，尤其是允许从轴突末端或通过血脑屏障有效地转移基因到中枢神经系统(CNS)的病毒载体，对于分析注射部位周围特定神经回路的结构和功能非常有用，而且能够通过将治疗基因传递到遥远的靶区而成为最有潜力和最有前途的治疗工具之一。与传统的逆行示踪剂相比，病毒载体可在特定神经元类群中表达基因，如光遗传的、化学遗传的和钙敏感的功能探针，被广泛应用于监测和操纵神经元活动。一些天然和工程化的嗜神经病毒表现出逆行感染能力，包括伪狂犬病毒(PRV)、单纯疱疹病毒(HSV)、狂犬病毒(RABV)、慢病毒(LV)、犬腺病毒(CAV)和腺相关病毒(AAV)等。其中，PRV具有高毒性；HSV和RV可以快速表达基因，具有很高的逆行标记效率，但对细胞也有较高的毒性，限制了长期的基因操纵和治疗。G/L双缺失的狂犬病毒降低了细胞毒性，但只有微弱的基因表达；改良RVG包装的慢病毒具有较高的逆行转运效率，但可能诱导宿主免疫应答或随机插入宿主基因组导致肿瘤发生；CAV-2的免疫原性相对较低，但基因表达水平适中且制备困难。

重组腺相关病毒(rAAVs)具有低毒、高水平的转基因表达和最小的宿主免疫应答等特性，已成为神经回路调控和基因治疗的有力工具。许多基因缺陷性脑疾病的治疗需要向整个大脑中的每个细胞补偿正确的基因，比如粘多糖症等。一些天然的和工程化的腺相关病毒可以通过轴突末端吸收或血脑屏障转运来转导大部分中枢神经系统神经元，包括AAV-TT、MNM004、AAV-PHP.eB和AAV-F等。然而，同时具有这两个重要特征的AAV还没有被报道。逆行感染AAV主要通过颅内注射来实现大部分细胞感染，没有静脉注射给药途径方便，但静脉注射给药后可能会产生抗体，不适合连续治疗，因此，开发能够多途径靶向大脑神经元细胞的腺相关病毒具有十分重要的意义。

为了实现上述目的，本发明设计了一种既能通过颅内注射从轴突末端高效逆行感染，也能通过静脉注射穿过血脑屏障等途径靶向大脑细胞的腺相关病毒病毒体，在神经科学、脑疾病模型建立和基因治疗等领域具有广泛的应用价值和市场前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有变异衣壳蛋白的腺相关病毒，该病毒既能从轴突末端高效逆行感染，也能穿过血脑屏障靶向大脑细胞。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

具有变异衣壳蛋白的腺相关病毒(命名为AAV9-RB)，即在野生型AAV9衣壳蛋白VP1的Q588与A589之间插入氨基酸序列LADQDYTKTA(SEQ ID NO.1)。

进一步地，AAV9-RB衣壳蛋白VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，构建获得的Rep-Cap质粒的全序列如SEQ ID NO.8所示。

AAV9-RB在通过轴突末端逆行感染或跨血脑屏障感染大脑细胞中的应用。

在本发明的具体实施例中，将AAV9-RB的Rep-Cap质粒与pAAV-CaMKIIa-EGFP质粒通过杆状病毒-AAV表达载体系统制备相应的rAAV9-RB-CaMKIIa-EGFP，再将病毒通过尾静脉注射或脑立体定位方式注射3个月龄C57BL/6小鼠腹侧被盖区，3-4周后灌流取脑和成像，结果表明AAV9-RB既能从轴突末端高效逆行感染，也能穿过血脑屏障靶向大脑细胞。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：