[发明专利]促进普鲁兰酶胞外表达的信号肽

说明书

本发明公开了促进普鲁兰酶胞外表达的信号肽，属于基因工程及酶工程技术领域。本发明是以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表达宿主，通过对枯草芽孢杆菌内源信号肽AprE、SacB、Epr进行同义突变，得到能使胞外蛋白量显著提高的同义突变序列，在保证蛋白正常翻译的同时，又能提高蛋白的表达量。Apre、Epr、SacB信号肽的同义突变序列分别能使胞外酶活较野生型提高2.92，1.08，1.37倍，从而为普鲁兰酶的胞外高效表达提供一种策略。

技术领域

本发明涉及促进普鲁兰酶胞外表达的信号肽，属于基因工程及酶工程技术领域。

背景技术

普鲁兰酶(pullulanase,EC 3.2.1.41)属于α-淀粉酶家族，能特异性水解支链淀粉的分支α-1,6-糖苷键，又称为淀粉脱支酶。但由于野生菌作为生产菌产普鲁兰酶时，存在诸多问题，包括培养困难，产量很低等，因此难以实现工业化大规模生产。随着基因工程的迅速发展，普鲁兰酶编码基因实现了在不同基因工程菌株中的异源表达。

我们前期研究中已经成功实现普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌的可溶性表达，而且已经用强启动子PlytR来驱动普鲁兰酶的表达(Yang,S等Characterization and applicationof endogenous phase-dependent promoters in Bacillus subtilis.Appl MicrobiolBiotechnol,2017)。但是通过目前的这些手段，虽然已经使得普鲁兰酶的胞外酶活得到了显著提升，但是依旧以满足大规模工业化的生产需求。因而如何能够进一步提升普鲁兰酶的胞外表达量，仍然是一个亟待解决的问题。

发明内容

为解决上述存在的问题，进一步提升普鲁兰酶的胞外表达量，本发明通过同义突变手段，以期能提高普鲁兰酶的胞外表达。基因的同义突变可使氨基酸序列不变，但可使基因转录水平发生显著的改变。本发明通过同义突变手段改造基因N端编码区，既可以实现基因表达量的显著提高，同时又对酶活的影响几乎可忽略不计。本发明通过同义突变筛选到的信号肽，能够显著提高普鲁兰酶的胞外酶活。

本发明提供了一类信号肽，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示任一。

在本发明的一种实施方式中，所述信号肽的核苷酸序列分别为信号肽AprE，SacB，Epr同义突变序列。

在本发明的一种实施方式中，所述信号肽AprE的同义突变序列如SEQ ID NO.1所示；所述信号肽SacB的同义突变序列如SEQ ID NO.2所示；所述信号肽Epr的同义突变序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的信号肽的重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述重质粒以任意可以在枯草芽孢杆菌中表达的载体为出发载体。

在本发明的一种实施方式中，所述出发载体包括P43NMK。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒上还含有组成型启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述组成型启动子包括LytR启动子，LytR启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供了含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的信号肽的重组菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以枯草芽孢杆菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以枯草芽孢杆菌WB600，或枯草芽孢杆菌168为宿主。

本发明提供一种提高蛋白表达量的方法，把含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1～3所示的信号肽的重组菌作为发酵菌株，生产蛋白。