[发明专利]谷氨酸脱羧酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种谷氨酸脱羧酶突变体及其应用，属于基因工程和发酵工程领域。本发明的谷氨酸脱羧酶突变体，其氨基酸序列是在SEQ ID NO.4的基础上缺失第453‑466氨基酸得到。该突变体的酶活在较宽的pH值范围内(4.2～6.0)保持对野生型谷氨酸脱羧酶的绝对优势，十分适用于γ‑氨基丁酸的工业化生产。

技术领域

本发明属于基因工程和发酵工程领域。

背景技术

谷氨酸脱羧酶(GAD)是合成γ-氨基丁酸(GABA)的关键酶，以5’-磷酸吡哆醛(PLP)为辅酶，且该催化过程不可逆。GAD广泛分布于各种生物体内的活细胞中，从哺乳动物到单细胞生物体(如多种细菌、古生菌和真菌微生物)中均有分布。来自不同生物体的GAD从其氨基酸序列到空间结构均有差异，从而导致不同来源的GAD拥有不同的化学特性、生理功能和酶学性质。研究发现，植物或动物的GAD一般在中性偏碱性范围内活性较好，微生物来源的GAD最适作用pH偏酸性环境，一般在4.0～5.5之间，而当环境pH＞5.5时，GAD活力急剧下降，甚至完全丧失催化活性。

γ-氨基丁酸(GABA)是一种广泛存在于哺乳动物、植物和微生物细胞的非蛋白氨基酸，由GAD专一催化L-谷氨酸或L-谷氨酸钠(L-MSG)脱羧而成。GABA是一种抑制性神经递质，有多种功能，在食品、医药及饲料等领域有广泛的应用。传统的GABA化学合成法和植物富集法存在成本高昂、反应条件剧烈、环境污染严重等问题，因此很难投入工业化生产。近年来，随着生物技术的不断发展，越来越多的研究者利用过表达GAD基因的微生物发酵合成GABA。由于发酵过程中需要外源添加底物L-谷氨酸钠(L-MSG)，使环境pH上升，而微生物来源的GAD在酸性范围内才具有良好的催化活性，在产酸阶段要外源添加大量的酸，因此会增加生产的成本。

为了加强微生物在较大pH值下保持高活性，研究人员尝试对GAD基因进行突变改造，获得了一定的成果。例如：THU等(Expanding the active pH range of Escherichiacoli glutamate decarboxylase by breaking the cooperativeness.Journal ofBioscience and Bioengineering，2013，115(2):154-158)发现，E.coli来源的GAD在pH6.0时基本完全丧失活力，而删除该GAD的C末端15个氨基酸残基(Δ452～466)时，突变体GAD(Δ452～466)的pH作用范围向碱性偏移的1个pH，该突变体在pH7.0时基本完全丧失活力。突变体Glu89Gln/Δ452～466的pH作用范围继续向碱性偏移的0.5个pH，其在pH7.5时基本完全丧失活力，Glu89Gln/His465Ala在pH8.5时基本完全丧失活力。但其突变的同时导致了GAD在最适pH值下活性显著降低。

目前通过基因突变来提高GAD在pH5.5环境中的活性，其提高幅度虽然可观，但从提高后酶活的绝对数值来说，仍然远远低于野生型GAD在最适pH值下的酶活；而且，突变后的GAD往往在pH≤5.5环境中的酶活显著降低。这样的改造，对节约GABA生产成本没有实际意义。如果能在提高GAD在pH5.5环境中的活性的同时，还能提高GAD在pH≤5.5环境中的酶活，将十分有利于节约GABA生产成本。

发明内容

本发明要解决的问题是：提供一种在pH 4.2～6.0范围内酶活均高于野生型GAD的GAD突变体及其应用。

本发明的技术方案如下：

一种谷氨酸脱羧酶突变体，其氨基酸序列是在SEQ ID NO.4的基础上缺失第453-466氨基酸。

一种谷氨酸脱羧酶突变体的基因片段，所述基因片段编码前述的突变体。

如前述的基因片段，所述基因片段的序列如SEQ ID NO.13所示。

一种重组质粒，所述质粒包括前述基因片段。