[发明专利]一种辅助全细胞转化合成L-天冬酰胺的方法

说明书

本发明公开了一种辅助全细胞转化合成L‑天冬酰胺的方法，本发明利用Ⅲ类多聚磷酸激酶2构建了单酶转化AMP再生ATP的系统，并将其应用于L‑天冬酰胺的生物合成。将来自Deinococcus ficus的Ⅲ类PPK2在Escherichia coli Rosetta(DE3)中表达，酶活力为13.19U·mL^‑1。以E.coli Rosetta(DE3)/pET21a‑DfiPPK2‑Ⅲ和B.subtilis WB600/pMA5‑LsaAS‑A全细胞为催化剂催化L‑Asp合成L‑Asn并优化反应条件。结果显示两种重组菌湿细胞在最优反应条件下，并通过两次补料终浓度为60mmol·L^‑1的六偏磷酸钠，L‑Asn的得率到达90.15％，比直接添加180mmol·L^‑1的六偏磷酸钠高80％。

技术领域

本发明涉及一种辅助全细胞转化合成L-天冬酰胺的方法，属于生物转化技术领域。

背景技术

L-天冬酰胺中文又称为2-氨基-3-氨基甲酰丙酸。为白色的斜方晶系晶体或结晶性粉末，略带甜味，熔点约234℃。溶于水，几乎不溶于乙醇和乙醚，水溶液呈酸性。遇碱会水解成天冬氨酸。加热其水溶液容易分解。天冬氨酸在食品、医疗、化工以及生物方面都有所应用

天冬酰胺的制备方法有直接提取法、化学合成法和生物合成法。直接提取法主要是以白羽扇豆为主，经过发芽、成浆、加热等处理流程后，在pH不大于6的条件下，经过硅藻土过滤、离心，获得第一步粗品。然后再经过浓缩、结晶获得最后的成品。直接提取法受原料质量的影响较大，工艺复杂不易控制且会造成严重的污染。化学合成法主要是通过氨水和L-天冬氨酸为原料进行酰胺化反应产生L-天冬酰胺，使L-天冬氨酸上的羟基由氨基替代。该方法副反应多，下游提取困难，污染严重。生物合成法主要是通过天冬酰胺合成酶催化谷氨酰胺的氨基转移，需要ATP参与。该方法生产过程和设备简单，生产效率高，但是由于转化过程中需要ATP的参与，但是ATP价格昂贵，成本过高，性质不稳定，且在合成过程中会积累副产物(AMP或者ADP)，不仅增加了产物分离提纯的难度同时还有可能会造成产物抑制。

前期尝试在只添加表达天冬酰胺合成酶A的全细胞合成的反应体系中添加葡萄糖，通过糖酵解途径再生ATP，合成L-天冬酰胺，但是没有成功。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明构建了表达III类多聚磷酸激酶2的重组基因工程菌，与产L-天冬酰胺合成酶的重组菌耦合反应再生ATP，只需在反应液中添加少量的ATP和底物，就能实现从L-天冬氨酸向L-天冬酰胺的生物转化，大大减少了生物合成的成本。

本发明的第一个目的是提供一种辅助全细胞转化合成L-天冬酰胺的方法，所述方法是采用表达III类多聚磷酸激酶2的重组菌与表达L-天冬酰胺合成酶的重组菌耦合反应，催化L-天冬氨酸转化为L-天冬酰胺。

进一步地，所述的表达III类多聚磷酸激酶2的重组菌为在大肠杆菌宿主中过表达核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的III类多聚磷酸激酶2。

进一步地，所述的大肠杆菌宿主为Escherichia coli Rosetta(DE3)。

进一步地，所述的表达III类多聚磷酸激酶2的重组菌是以pET21a为表达载体。

进一步地，所述的表达L-天冬酰胺合成酶的重组菌为重组菌B.subtilis WB600/pMA5-LsaAS-A。构建方法参照《天冬酰胺合成酶的基因挖掘与酶学性质研究》中国科技论文在线。