[发明专利]一种基于MCDA-LFB技术的B组链球菌检测方法及其专用引物组

说明书

本发明公开了一种基于MCDA‑LFB技术的B组链球菌检测方法及其专用引物组。本发明设计了能够针对B组链球菌cfb基因进行特异性扩增的成套引物组，并建立了针对B组链球菌的敏感、特异的MCDA‑LFB快速检测体系。通过实验证明：本发明提供的基于MCDA‑LFB技术的B组链球菌检测方法可以在30分钟内完成整个MCDA扩增，检测下限可以低至100fg，具有非常高的灵敏度。另外，本发明提供的扩增方法具有很高的扩增特异性，能准确地鉴别B组链球菌与其他常见致病菌，无假阳性及假阴性结果产生。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于MCDA-LFB技术的B组链球菌检测方法及其专用引物组。

背景技术

B组链球菌(Group B streptococci，GBS)感染是新生儿和孕产妇面临的严重问题。在新生儿，B组链球菌可入侵血液引起严重的侵袭性感染，如肺炎、败血症、脑膜炎等。定植于孕妇阴道和直肠的GBS可造成逆行性的感染，对妊娠结局产生较大的影响，如早产、产后出血等。为了减少新生儿感染GBS的可能，目前临床医生根据风险评估经验性给予抗生素预防性干预，但缺乏早期准确GBS检出实验室诊断技术，会导致漏诊误诊的可能。因此，亟需研发快速、准确的诊断GBS的技术以更好的治疗和管理患者。

传统的检测GBS的方法有：细菌培养和免疫学检测。目前，诊断GBS的金标准为在选择性培养基中对样本进行培养。然而，培养所需时间较长，一般需要48小时才能得到阳性的结果，且培养的敏感性较低。血清学检测由于其假阴性率和假阳性率很高，使得这种方法的应用迅速减少。一些酶免疫分析、对流免疫电泳等方法可对GBS进行分型，但需要昂贵的试剂盒及高滴度的抗血清，限制了其在临床上的应用。因此，大量的工作都致力于以核酸为基础的检测GBS的方法。在这方面，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)可以实现快速、准确检测目标病原体。但它需要热循环仪器和复杂的操作程序，并且需要专业的实验操作员进行规范操作，使得它们在欠发达地区无法实现推广应用。GeneXpert分子诊断系统(系美国产品)亦可实现GBS的床旁快速检测，具有较高的敏感性和特异性，且该试剂盒操作简便，但由于单次检测的价格为38.8英镑，其昂贵的价格限制了应用。

近年来恒温扩增技术发展迅速，可以在恒定温度下实现快速有效的核酸扩增，因此无需使用热循环扩增设备，简单的PCR仪即可实现。目前已有10余种恒温核酸扩增技术应用于实验室，例如超支化滚环扩增(HRCA)、解旋酶依赖的恒温扩增(HDA)、链置换扩增(SDA)、环介导恒温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)等。除LAMP仅需一种DNA聚合酶就可实现扩增外，其他方法均需要其它的酶或蛋白质共同工作才能实现扩增。这些检测方法存在不够快速、敏感、特异的问题。

为克服PCR技术和现有的恒温扩增技术的劣势，实现简单、快速、灵敏、特异的核酸诊断，发明人近期新建了一种核酸扩增技术，命名为多交叉置换扩增(Multiple CrossDisplacement Amplification，MCDA)。MCDA(多交叉恒温扩增)在恒温条件下实现核酸扩增，仅使用一种恒温置换酶、扩增速度快、反应灵敏、特异性高。此外，为了进一步提高MCDA技术的推广价值，发明人还将MCDA技术与纳米生物检测技术相结合，开发了依赖MCDA技术，实现快速、敏感检测的纳米生物传感技术，该技术被命名为多交叉恒温扩增结合纳米生物传感的核酸诊断技术(Multiple Cross Displacement Amplification label-basedNanoparticles Lateral Flow Biosensor，MCDA-LFB)。

发明内容

本发明的第一个目的是提供用于检测或辅助检测B组链球菌的成套引物组。

本发明提供的用于检测或辅助检测B组链球菌的成套引物组由引物1-引物10组成；

所述引物1为如下a1)或a2)：

a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；