[发明专利]一种Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法

权利要求书

1.一种Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：将Sf9细胞在添加硫酸葡聚糖的Sf-900 III SFM培养基中重悬并将Sf9细胞稀释至0.6-1.0×10⁶ cells/mL；

步骤2：添加热灭活胎牛血清至步骤1中，对Sf9细胞进行培养；

步骤3：当步骤2中Sf9细胞密度在第三天达到4×10⁶ cells/mL以上，重复步骤1和2；

其中，每重复一次步骤1和步骤2，添加的热灭活胎牛血清的量逐步降低直至不添加热灭活胎牛血清依然可以使Sf9在第三天细胞密度达到4×10⁶ cells/mL以上；

步骤1中的Sf-900 III SFM培养基中硫酸葡聚糖的终浓度为20-30mg/L；

步骤1-2重复为6次，其中，初次重悬培养Sf9细胞的培养基热灭活胎牛血清的质量浓度为9-11%；第二次和第三次重悬培养Sf9细胞的培养基热灭活胎牛血清的质量浓度为6-8%，第四次、第五次、第六次重悬培养Sf9细胞的培养基热灭活胎牛血清的质量浓度为3-4%。

2.根据权利要求1所述Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法，其特征在于，当不添加热灭活胎牛血清依然可以使Sf9细胞密度达到4×10⁶ cells/mL以上后，悬浮培养Sf9细胞的Sf-900 III SFM培养基不再添加硫酸葡聚糖。

3.根据权利要求1所述Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法，其特征在于，在步骤1之前还包括：

步骤0-1：贴壁培养Sf9细胞至汇合率达到90％以上时，倒掉培养液，使用PBS洗2遍，倒掉PBS后用电动移液器吸去方瓶底部残液，彻底除去影响胰酶消化的血清；

步骤0-2：加入胰酶，摇晃均匀后静置1-3min，待消化完全后加入FBS终止消化。

4.根据权利要求3所述Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法，其特征在于，步骤0-2：加入胰酶消化时间为1min。

5.根据权利要求1-4任一所述Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法，其特征在于，步骤1中，Sf9细胞稀释至0.8×10⁶ cells/mL。

6.根据权利要求1-4任一所述Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法，其特征在于，步骤2中培养体系在摇瓶中采用摇床进行培养；

每重复一次步骤1和步骤2，摇床速度增加5rpm，摇床起始速度为90 rpm，摇床目标速度为120 rpm。

7.根据权利要求6所述Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法，其特征在于，采用摇床进行培养时，培养温度为28℃。

8.根据权利要求1-4任一所述Sf9细胞的无血清全悬浮驯化方法，其特征在于，在任一一次重复步骤1和步骤2的过程中，如果步骤2中Sf9细胞密度在第三天低于4×10⁶ cells/mL，该次重复步骤1和步骤2的行为不计入重复次数，且离心细胞重新开始步骤1和步骤2，步骤2中的灭活胎牛血清的浓度和上一轮的步骤2中的灭活胎牛血清浓度相同。