[发明专利]一种特异性抗吡唑醚菌酯抗体的可变区序列及其重组全长抗体

说明书

本发明公开了一种特异性抗吡唑醚菌酯抗体的可变区序列，重链可变区编码基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示。本发明还公开了一种抗吡唑醚菌酯重组全长抗体，包括重链恒定区、重链可变区、轻链恒定区和轻链可变区，重链可变区编码基因的氨基酸序列为如SEQ ID NO:2所示。本发明又公开了一种抗体表达质粒。将本发明得到的序列基因分别连接到包含了重链恒定区基因和轻链恒定区基因的表达载体，采用双质粒系统的哺乳动物细胞表达获得了重组全长抗体，与鼠源亲本抗体的识别活性一致，并使得抗吡唑醚菌酯抗体可大批量稳定生产，为吡唑醚菌酯残留检测的各种免疫分析方法提供了可靠的核心试剂。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其是涉及一种特异性抗吡唑醚菌酯抗体的可变区序列及其重组全长抗体的制备与应用。

背景技术

吡唑醚菌酯是一种由德国巴斯夫公司(BASF)在1993年开发的新型嗜球果伞菌素杀菌剂，它通过防止细胞色素B和C1之间的电子转移、抑制线粒体呼吸作用并抑制ATP的产生，最终导致致病性真菌无法进行正常的生理代谢而死亡。吡唑醚菌酯作为一种环保型杀菌剂，对非目标生物危害较小，但有报道发现其对蚕、斑马鱼存在一定的线粒体毒性和神经毒性，因此在农业生产中应控制吡唑醚菌酯的使用。根据最新的国家标准(GB 2763-2019)，吡唑醚菌酯在谷物中的最大残留限量为0.2-1.0mg/kg，油料作物的最大残留限量为0.05-0.4mg/kg，蔬菜的最大残留限量为0.02-20mg/kg，水果中为0.05-4mg/kg，茶叶中为10mg/kg，其他类别为0.02-5mg/kg。

目前，对吡唑醚菌酯残留的检测主要使用大型精密仪器如液相色谱、气相色谱-质谱联用、超高效液相色谱-质谱联用等方式；然而，这些仪器价格昂贵、样品准备过程复杂并且需要专业人员操作，因此很有必要研发一种快速、便捷、能够现场筛查吡唑醚菌酯残留的检测技术。

自上世纪末，基于抗原-抗体反应的免疫分析方法被广泛应用，该方法的核心为高灵敏度高亲和性的抗体。第一代抗体为多克隆抗体，虽然制备方式简单，但抗体特异性相对较差。第二代抗体为基于杂交瘤细胞融合技术获得的高灵敏度和高亲和性的单克隆抗体。2008年，JOSEP V.MERCADER等人获得了一种抗吡唑醚菌酯的高亲和力单克隆抗体，并开发了酶联免疫吸附测定方法(ELISA)用于吡唑醚菌酯的检测，其检出限(LOD)低于0.1μg/L(Mercader,J.V.,Suárez-Pantaleón,C.,Agulló,C.,Abad-Somovilla,A.,Abad-Fuentes,A..Production and Characterization of Monoclonal Antibodies Specific to theStrobilurin Pesticide Pyraclostrobin[J].Journal of Agricultural and FoodChemistry.2008,56(17):7682-7690.)；2011年，他们合成了多种位点异源半抗原，以筛选出亲和力更高的吡唑醚菌酯特异性单克隆抗体(Mercader,J.V.,Agulló,C.,Abad-Somovilla,A.,Abad-Fuentes,A..Synthesis of site-heterologous haptens forhigh-affinity anti-pyraclostrobin antibody generation[J].OrganicBiomolecularChemistry.2011,9(5):1443.)；2013年，他们将ELISA与QuEChERS预处理方法相结合，用于分析六种水果中吡唑醚菌酯的残留(Mercader,J.V.,Agulló,C.,Esteve-Turrillas,F.A.,Abad-Somovilla,A.,Abad-Fuentes,A..Immunoassays for pyraclostrobin analysisin processed food products using novel monoclonal antibodies and QuEChERS-based extracts[J].Food Control.2013,32(1):42-48.)。