[发明专利]一种由SNP所引起利福平类抗生素耐药的抗性基因的特异性引物的设计方法及检测方法

说明书

本发明提供一种由SNP所引起利福平类抗生素耐药的抗性基因的特异性引物的设计方法及检测方法，该设计方法包括以下步骤：步骤一、获取抗性基因的核苷酸序列；步骤二、对核苷酸序列进行引物设计，生成候选引物；步骤三、根据候选引物的参数进行筛选，得到特异性引物对。本发明实施例的设计方法至少具有如下有益效果：通过对引物参数的设定并进行筛选，设计得到具有较高的特异性，设计得到的特异性引物对可以通过PCR扩增直接得到抗性基因的全长序列，大大简化操作步骤。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种由SNP所引起利福平类抗生素耐药的抗性基因的特异性引物的设计方法及检测方法。

背景技术

利福平为利福霉素类半合成广谱抗菌药，对金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌等多种病原微生物均有抗菌活性，主要应用于肺结核和其他结核病的治疗。近年来，由于结核病的发病率开始上升，利福平的滥用，造成环境中的利福平的含量逐年升高，这也导致环境中利福平耐药菌株的检出率显著升高。

利福平通过与细菌DNA依赖的RNA聚合酶亚基特异性结合，抑制RNA聚合酶的活性，干扰细菌DNA的转录起始，阻碍蛋白质合成从而发挥杀菌作用。RNA聚合酶由5个亚单位组成，其中的β亚单位由rpoB基因进行编码。rpoB基因突变是细菌的利福平类抗生素耐药的主要机制。rpoB基因的少数密码子发生突变后，其编码的氨基酸改变，使RNA聚合酶分子原有的利福平结合点的构象发生改变。利福平无法与RNA聚合酶分子结合，从而导致利福平耐药，这在多种细菌中都得到了证实。

虽然90%左右的利福平耐药菌株的突变发生在其利福平耐药决定区（RifampinResistance Determining Region，RRDR），包括cluster Ⅰ（507-533位氨基酸）、cluster Ⅱ（563-572位氨基酸）等，但仍有不少突变位点位于利福平耐药决定区以外。因此，获取细菌的rpoB基因全长序列，并对其相应的SNP位点分析就显地尤为重要。然而，rpoB基因全长在3kb以上，属于长片段基因序列。目前对于长片段基因序列的获取主要通过克隆载体测序的方式，但存在操作复杂、耗时长等问题。而常规的PCR反应对于3kb以上的DNA片段很难扩增，即便扩增成功但产量较低，难以进行进一步的检测分析。因而，有必要提供一种能够筛选利福平类抗生素耐药的抗性基因的特异性引物的设计方法。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种能够筛选由SNP所引起利福平类抗生素耐药的抗性基因的特异性引物的设计方法及检测方法。

第一方面，本发明的一个实施例提供了一种由SNP所引起利福平类抗生素耐药的抗性基因的特异性引物的设计方法，该设计方法包括以下步骤：

步骤一、获取抗性基因的核苷酸序列；

步骤二、对核苷酸序列进行引物设计，生成候选引物；

步骤三、根据候选引物的参数进行筛选，得到特异性引物对。

本发明实施例的设计方法至少具有如下有益效果：

通过对引物参数的设定并进行筛选，设计得到具有较高的特异性，设计得到的特异性引物对可以通过PCR扩增直接得到抗性基因的全长序列，大大简化操作步骤。