[发明专利]一种熊去氧胆酸的制备方法

说明书

为了解决熊去氧胆酸的生物制备需要过量共底物来实现辅因子再生的问题，本发明通过在黄素还原酶的作用下，以核黄素为底物，实现了共底物的催化量加入，利用空气中的氧气作为底物大大降低了由鹅去氧胆酸氧化为7‑羰基石胆酸的生产成本。以7‑羰基石胆酸为底物，异丙醇为共底物，底物浓度可以有效提高。本发明为熊去氧胆酸的绿色生产提供了一条廉价的生物催化工艺。

技术领域

本发明涉及利用多种氧化还原酶作为催化剂，以鹅去氧胆酸为底物制备熊去氧胆酸，属于生物工程领域。

背景技术

胆酸及其衍生物具有广泛的生物活性，是内源性的天然产物。由于其本身高度的光学纯度和两亲的分子的结构特点，生物活性研究一直是药理学和药物发现领域的研究热点之一。胆酸类药物己经在临床上有应用，如熊去氧胆酸及牛横熊去氧胆酸已用于肝脏疾病的治疗(熊去氧胆酸联合来适可治疗脂肪肝合并高脂血症患者的效果，魏鸿，2017，30,133)，。而近几年来，胆酸及其衍生物的药理活性研究取得了很大的突破，2015年，FDA批准了两个胆酸类药物上市，分别为用于治疗胆汁酸合成障碍罕见病的Cholham胶囊(主要成分为胆酸)和用于颏下脂肪的溶脂针剂Kybella(主要成分为脱氧胆酸)。

传统的熊去氧胆酸制备的文献(NAD⁺-Dependent Enzymatic Route for theEpimerization of Hydroxysteroids,Fabio Tonin,Linda G.Otten,IsabelW.C.E.Arends, 2018,11,1-13；Flavin Oxidoreductase-Mediated Regeneration ofNicotinamide Adenine Dinucleotide with Dioxygen and Catalytic Amount ofFlavin Mononucleotide for One-Pot Multi-Enzymatic Preparation ofUrsodeoxycholic Acid,Xi Chen,Yunfeng Cui,Jinhui Feng, Yu Wang,Xiangtao Liu,Qiaqing Wu,Dunming Zhu,Yanhe Ma,2019,DOI: 10.1002/adsc.201900111)虽然是一锅法进行，但是往往需要使用共底物来实现辅酶的再生。尤其是第一步的氧化过程中，往往需要过量的共底物加入推进反应的进行。

上式为鹅去氧胆酸制备熊去氧胆酸

发明内容

为了有效的降低从鹅去氧胆酸制备熊去氧胆酸的生产成本，本发明通过使用催化量的共底物加入，降低熊去氧胆酸的生产成本。

本发明的有益效果：通过更改辅酶再生方法，有效的降低了共底物的使用量从而降低了生成成本，为熊去氧胆酸的制备提供了一条廉价的制备方法。

具体实施方式

下面的实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。

本发明中使用的黄素还原酶基因来源于Mycobacterium goodii的核黄素还原酶(MFR)(GenBank:ABX11274.1)，7α-羟基甾体脱氢酶(7α-HSDH)基因来源于 Brevundimonassp.(GenBank:WP_046653274.1)，7β-羟基甾体脱氢酶(7β-HSDH)基因来源于Clostridiumsp.Marseille(GenBank:WP_066892209.1)，TB醇脱氢酶(TBADH) 基因来源于Thermoanaerobacter ethanolicus(GenBank:X64841.1)将上述构建到pET21a 或者pRSFDuet-1表达载体上。将重组质粒转入宿主菌细胞(优选大肠杆菌BL21 (DE3))，获得相应的工程菌株。将工程菌株接种至L-B培养基中，25℃培养16 小时。离心收集菌体，破菌留取上清液。

实施例1：黄素还原酶与7α-胆酸脱氢酶制备7-Keto-石胆酸