[发明专利]一种高效诱导培养制备自然杀伤性NK细胞的方法

权利要求书

1.一种高效诱导培养制备自然杀伤性NK细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、准备阶段：用重组人纤粘连蛋白、CD16抗体包被细胞培养瓶；

S2、外周血单核细胞诱导培养：

S21、收集外周血；

S22、制备自体血浆和自体血清；

S23、将自体血浆进行分离，获得外周血单核细胞，并配置细胞悬液；

S24、接种细胞：将步骤S23配制的细胞悬液加入到步骤S1包被过的细胞培养瓶中，加入无血清细胞培养基，添加CD3单抗、Her-2、IFN-γ及步骤S22的自体血清；

S25、将接种后的细胞培养瓶置于细胞培养箱中培养；

S3、扩增培养：

S31、培养第4天，按（2.0~2.5）*10⁶细胞密度补加无血清细胞培养基，同时补加细胞扩增阶段细胞因子、10%自体血清；

S32、第5~11天，每天按（2.0~2.5）*10⁶细胞密度补加无血清细胞培养基，同时补加细胞扩增阶段细胞因子；

S33、培养14天后，收获NK细胞；

S4、采用台盼蓝染色法，用细胞计数板进行细胞计数，计算细胞数和细胞活率。

2.如权利要求1所述的一种高效诱导培养制备自然杀伤性NK细胞的方法，其特征在于，所述步骤S1的包被细胞培养瓶的过程为：配制包被液：50mL离心管中加入D-PBS缓冲液20mL，加入重组人纤粘连蛋白至8-20μg/mL，加入CD16抗体至0.18-0.22μg/ml；包被：将上述配制好的包被液加入T175细胞培养瓶中，平放，混匀，4℃避光过夜包被，即得。

3.如权利要求1所述的一种高效诱导培养制备自然杀伤性NK细胞的方法，其特征在于，所述步骤S22~S23的过程如下：将步骤S1采集的外周血在室温下、700g离心20min，上层为血浆层，下层为白细胞和红细胞层；轻轻吸出上层血浆，将吸出的血浆置于56℃恒温水浴中30min灭活补体；灭活后的血浆于4℃静置15min，再于4℃、800g离心25min，收集上清，作为自体血清备用；添加淋巴分离液，室温下800g离心20min；离心后中间的白色雾层细胞即为外周血单核细胞（PBMC），用巴斯德吸管将白色的PBMC层吸出，加入PBS清洗，于1500rpm离心8min，弃上清；再次用PBS清洗，1200rpm清洗6min，弃上清；置于培养基中重悬，混匀，取样0.5mL计数，1000rpm离心6min，弃上清；将末次洗涤时收集的细胞沉淀用无血清培养基重悬，混匀，即得。

4.如权利要求1所述的一种高效诱导培养制备自然杀伤性NK细胞的方法，其特征在于，所述步骤S23中的细胞悬液的细胞密度为（1~2）*10⁶/ml。

5.如权利要求1所述的一种高效诱导培养制备自然杀伤性NK细胞的方法，其特征在于，所述步骤S24中，无血清细胞培养基加入量为40ml，分别添加CD3单抗、Her-2、IFN-γ浓度至0.9 -1.4μg/ml、0.12-0.25μg/ml、0.3-1.0μg/ml，自体血清添加终浓度（重量浓度）为10%。

6.如权利要求1所述的一种高效诱导培养制备自然杀伤性NK细胞的方法，其特征在于，步骤S31、S32所述的细胞扩增阶段细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-15、IL-18、IL-21中的一种或多种。

7.如权利要求1所述的一种高效诱导培养制备自然杀伤性NK细胞的方法，其特征在于，步骤S31、S32所述的细胞扩增阶段细胞因子的添加终浓度分别为：IL-2 10-14 ng/mL，IL-715-25 ng/mL，IL-15 46-55 ng/mL，IL-18 10-13 ng/mL，IL-21 2-8 ng/mL。