[发明专利]一种筛选鉴定胁迫应答基因表达调控因子的方法

说明书

本发明公开了一种筛选鉴定胁迫应答基因表达调控因子的方法。本发明开发了一种富集蛋白结合基因组DNA片段以构建用于识别能够应答环境胁迫的克隆的荧光素酶报告文库的方法。通过利用E.coil作为制备细胞裂解液和基因组DNA片段这二者的模型系统；将细胞裂解液与基因组DNA片段混合，富集了蛋白结合DNA片段并用膜旋转柱将其与未接合的DNA片段分离，该蛋白结合DNA片段用于制作荧光素酶报告文库，转化DH5α后，在Amp抗生素板上筛选抗性克隆；用丝裂霉素C或亚坤酸盐处理，都鉴定到了显示2倍荧光素酶诱导的克隆，进一步分析也证实了其相关性；说明本筛选鉴定方法高效、准确。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种筛选鉴定胁迫应答基因表达调控因子的方法。

背景技术

微生物对重金属、农药和多氯联苯(PCBs)等环境毒性胁迫具有较强的适应性，这与它们对环境营养变化的快速应答相似。通过诱导或抑制基因表达来控制对其环境变化的适应。转录因子(TF)与其DNA结合位点的结合或分离是启动其靶基因转录的关键步骤。从整个基因组中鉴定和表征与环境胁迫应答相关的基因是至关重要的。这将有利于理解基因调控机制，也有利于识别出宿主环境适应过程中关键调控因子。然而，由于缺乏更加简单且高效的方法，许多有毒物质及其应答基因并未得到很好地表征。

目前有很多不同的鉴定和表征DNA-蛋白质相互作用的方法，如启动子文库筛选、DNA微阵列、染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)以及指数富集配体系统进化技术(SELEX)。由于E.coil基因组的序列已知性，已对全基因组100-200个碱基对(bp)启动子区进行物理扩增和克隆来构建启动子-绿色荧光蛋白(GFP)报告基因质粒。通过差异荧光诱导或抑制，可选择含转录活性调控区的细菌，并使用流式细胞术鉴定胁迫应答基因。然而，在筛选之前需要了解靶微生物序列和创建全基因组启动子-GFP文库。DNA微阵列是一种在全球范围内研究转录诱导或抑制的流行方法。通常，通过比较有毒胁迫与对照之间的基因表达可检测出基因组内的应答靶标。微阵列分析的复杂性包括其重复性和大规模的基因表达数据；因而，有必要尝试对DNA阵列中的初步鉴定的靶标进行验证。

ChIP-seq是另一种全球通用的方法，该方法已被应用于通过搜索全染色体DNA结合序列来识别特异性FTs的DNA结合位点。与需要从已知序列中提取探针的DNA阵列不同，ChIP-seq不需要明确在先的序列。SELEX已用于从具有所有可能序列的合成寡核苷酸文库中选择和测定DNA结合序列。以基因组DNA片段代替合成寡聚体文库作为诱饵的基因组SELEX筛选已经发展起来。可以在基因组DNA中找到并定位靶标，但是ChIP-seq和基因组SELEX在分析之前都需要了解与胁迫对应的TF。

除了证明存在蛋白质-DNA相互作用的实验证据以外，计算工具可基于结合TF的共有序列预测相互作用。由于高通量基因组测序技术的发展，许多微生物基因组已被完全测序。这导致形成了可在这些微生物基因组中识别转录因子结合位点(TFBS)的高效可靠的计算方法。由于基因组序列中的启动子区域通常不遵循特定的序列模式或基序，因此识别启动子区域的位置和功能是一个挑战。可通过已被开发用以发现保守区域的TFBS发现算法来搜索和识别靶基因中TF的结合位点。尽管这些预测区域的工具已基本上得到了改善，但是它们还并不完美。由于使用标准实验室培养技术仍然无法培养环境中的大部分细菌，因此研究其环境胁迫介导的基因表达和调控是具有挑战性的。

除了实验过程耗时以外，以上所有的传统实验方法都是基于已知的基因组序列或TF序列。除了微生物群落外，在不了解其基因组和TF的情况下，还没有开发出一种通用性的方法来鉴定和确定与环境胁迫相对应的基因表达调控中所需的TF或TFBS。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种筛选鉴定胁迫应答基因表达调控因子的方法。

本发明中提出了一种高通量方法，这种高通量方法是基于用于构建荧光素酶文库的蛋白结合基因组DNA片段的特异性选择。由于文库的规模较小，筛选鉴定胁迫诱导的克隆差异表达很容易完成。