[发明专利]用于特异性识别硒代半胱氨酸的萘衍生物双光子探针及其制备和应用

说明书

本发明涉及小分子荧光探针的研究，具体涉及用于特异性识别硒代半胱氨酸的萘衍生物双光子探针及其制备和应用，合理设计和合成了一种新颖的基于萘衍生物的双光子荧光探针BNT，可用于活细胞中硒代半胱氨酸的检测与成像。本发明荧光反应十分迅速，在10min，荧光强度达到最大，且检出限低至10.6nm,并且具有灵敏度高、光照稳定性好、特异性强、pH稳定性、细胞毒性低等优点。将该探针用于活细胞，可成功地追踪活细胞和组织中内源性和外源性硒代半胱氨酸的动态分布情况。

技术领域

本发明涉及小分子荧光探针的研究，具体涉及用于特异性识别硒代半胱氨酸的萘衍生物双光子探针及其制备和应用。

背景技术

硒代半胱氨酸(Sec)是人体中硒的主要存在形式，研究表明，在超营养水平时，Sec具有阻止肿瘤发生发展的作用，这种作用已经被大量的临床实验证实。Sec作为SePs的主要活性位点，已知硒蛋白(SePs)具有多种细胞功能，并已被确认与多种人类疾病有关。如炎症、心血管疾病、神经退行性疾病和癌症等。因此，为了更好的研究Sec在各种生理疾病中的功能，迫切需要开发一种精准快速的方法来监测生物体系中Sec的动态变化情况。

Sec作为一种分子指标，在生物体内含量低至纳摩尔甚至微摩尔级别，在生物体系中检测时，很容易受到高浓度的生物硫醇的干扰，比如GSH、Cys、Hcy,因为它们具有和Sec具有相似的化学性质，另外，现有检测Sec方法，如质谱法、气相色谱法、液相色谱法等方法，样品制备复杂、实验条件苛刻，仪器昂贵，操作繁琐，最主要的原因是无法对生物样品中Sec的功能提供生理上相关的见解。所以在生物系统中精确特异性识别Sec是一个巨大的挑战。

荧光分析法由于其可直接用于活细胞中监测分析物，而且灵敏度高、选择性好、响应时间短、高时空分辨成像、成本低廉等优势受到科研界的广泛认可，然而虽然荧光技术可直接在亚细胞和分子水平上对Sec进行实时传感，相较于直接用于检测生物硫醇的荧光探针相比，目前研究Sec的荧光探针仍然非常有限，通常都是紫外光或者可见光来激发，而且斯托克斯位移相对较小，在进行组织和细胞成像时易仍然存在着背景干扰强、信号可变性和成像深度浅等局限性，严重阻碍了其在活体样品中，特别是在深部组织中提供可靠的Sec定量成像分析，这些是我们在目前研究中急需解决的一个重要问题。

发明内容

本发明为解决现有技术中的上述问题，我们首先利用Sec的pKa＝5.8；生物硫醇的pKa＝8.5，Sec更有可能以去质子化形式，在生理pH＝7.4条件下，Sec几乎完全作为硒化物(R-Se-)，而大部分生物硫醇是非电离形式(R-SH)，所以，Sec具有更强的亲核性特点。并利用具有较高的荧光量子产率、较大的双光子吸收截面、较好的光稳定性以及简单的合成和易于修改等优点的带羟基萘衍生物作为荧光探针的信号输出核心，最后，利用2,4-二硝基苯磺酸基团一方面具有强拉电子作用，促使荧光团发生荧光猝灭，另一方面在生理条件下(pH＝7.4)具有较高的亲核性，Sec可特异性和磺氧基发生亲核取代反应，致使其脱落，恢复萘衍生物的电子供体-∏-电子受体结构，产生强烈荧光，从而实现对的Sec荧光检测。本发明是首次实现在生理条件下利用硒代半胱氨酸可以以去质子化形式和2,4-二硝基苯磺酰基发生亲核取代反应的化学反应原理，设计一种基于萘衍生物的双光子荧光探针直接用于活细胞内外源性和内源性的硒代半胱氨酸的检测的技术。

本发明的技术方案是，一种用于特异性识别硒代半胱氨酸的萘衍生物双光子探针，其中，采用具有电子供体-∏-电子受体的萘衍生物为双光子荧光团，以2,4-二硝基苯磺酰基为硒代半胱氨酸的特异性识别基团，该萘衍生物的双光子探针结构式如下：

本发明还提供所述用于特异性识别硒代半胱氨酸的萘衍生物双光子探针的制备方法，其包括如下步骤：

(1)称取6-羟基-2-萘甲醛溶解在乙醇溶液中，加入对甲苯磺酸一水化合物助溶；

(2)再将2-氨基苯硫酚溶解在乙醇溶液中，半小时内逐滴加入至反应装置，滴加完后，搅拌回流；