[发明专利]高通量PCR微滴荧光检测装置及方法

说明书

本发明公开了高通量PCR微滴荧光检测装置，包括：微滴芯片包括基板层、封闭盖片层，盖片层与基板层之间形成反应腔，盖片层于设有加样孔；加样系统，其包括微针、加样驱动机构、压力驱动机构、及用于容纳进行PCR所需的样品和原料的加样箱，所述压力驱动机构为所述加样箱提供压力、使得所述加样箱内的样品和原料经过所述微针注入至对应的所述反应腔内；温控系统，用于检测和提供PCR循环的温度；荧光检测系统，用于获取反应腔内的激发荧光。本发明提供的高通量PCR微滴荧光检测装置利用微滴芯片集成化、微型化特点，实现了样品微滴制备、核酸扩增及检测于一体，简化了操作流程，有效防止了外界污染和核酸交叉污染。

技术领域

本发明涉及生物医学检验领域核酸检测领域，特别涉及一种高通量PCR微滴荧光检测装置及方法。

背景技术

在肿瘤早期诊断筛查、血液病毒分型及载量分析、无创产前诊断等领域，都需要对超低浓度的核酸进行高速高灵敏度高特异性的检测，常规的PCR已越来越无法满足需求。为实现此功能，人们在PCR基础上，发展了一种数字PCR技术，将检测灵敏度提高了1～2个数量级。

微滴式数字PCR采用的“分而治之”(divide and conquer)的检测策略，将样品、PCR试剂混合物作为分散相，将油作为连续相，利用微流控技术，将样品混合物形成一个个液滴悬浮于连续相中。进而，将一个标准PCR扩增分配至大量微滴(纳升至皮升)中，每个微滴中仅包含0个或1个拷贝的目标分子(DNA模板)。对每个微滴进行独立PCR扩增，扩增结束后，检测每个微滴的荧光，对阳性信号的微滴进行计数，从而得到样品模板的绝对拷贝数和核酸浓度。微滴的尺寸和数量决定了数字PCR的检测灵敏度和下限，现有的数字PCR微滴数在2万～1000万之间。

现有的商用微滴式数字PCR技术操作如下：在专用的微滴制备芯片上制备液滴；通过移液器将微滴转移至离心管中，使用常规的PCR仪进行温度循环扩增；扩增完成后，利用流式技术依次对每个微滴进行荧光激发与探测，计算结果。这样的检测方式存在以下问题：

(1)流式检测速度较慢，检测速度在200～500个/s，检测过程耗时久，通量低；

(2)只能对单个微滴进行终点法检测,不能实时qPCR，降低了特异性和灵敏度；

(3)光路硬件复杂，难以实现多重数字PCR检测(4重以上)；

(4)两次液滴的转移过程将导致微滴损失，以及可能引来的外界污染；

(5)常规PCR扩增仪的加热块热惯量大，热循环时间长(2小时左右)。

为了利用数字PCR芯片进行核酸检测，一方面需要对该数字PCR微流控芯片进行温度循环扩增，另一方面需要对数字PCR液滴单层进行实时激光激发和荧光成像探测。每温度循环一次，便进行一次液滴荧光图像检测，以获得每个液滴的荧光连续变化曲线。为提高通量，在一块芯片上，可集成多个一体式数字PCR微流控结构，形成32个、48个甚至96个样品的同时检测，以便提高通量，这样便需要芯片可以进行一维或二维的运动，以便可以通过扫描方式进行大面积图像采集。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的问题，提出以下技术方案。

一种高通量PCR微滴荧光检测装置，包括：

微滴芯片，其包括用于承载反应微滴的基板层、封闭盖合于所述基板层上方的盖片层，所述盖片层与所述基板层之间形成多个反应腔，所述盖片层于每一所述反应腔对应开设有一加样孔；

加样系统，其包括微针、加样驱动机构、压力驱动机构23、及用于容纳进行PCR所需的样品和原料的加样箱，所述加样箱固定于所述加样驱动机构的动作末端，所述微针固定于所述加样箱上并与所述加样箱连通，所述微针设置多个，所述加样驱动机构驱动所述微针插入至对应的所述加样孔中，所述压力驱动机构23为所述加样箱提供压力、使得所述加样箱内的样品和原料经过所述微针注入至对应的所述反应腔内；