[发明专利]一种原位检测外泌体多重microRNA的纳米金荧光探针及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种原位检测外泌体多重microRNA的纳米金荧光探针及其制备方法与应用。其由纳米金、microRNA的捕获DNA、microRNA的报告DNA制成；其中，所述的报告DNA标记有不同的荧光基团，所述的捕获DNA标记有巯基基团；所述的microRNA包括miR‑1246、miR‑21；所述的microRNA还包括：miR‑54；所述的捕获DNA与所述的巯基基团之间还包括间臂。该探针可以监测探针测定细胞上清或血浆外泌体过程中产生的假阳性信号，确保检测过程中探针与检测体系的正常稳定状态；相比单靶标miR‑1246探针，该探针对乳腺癌血浆的检测具有更高的灵敏度和准确性。

技术领域

本发明属于分子生物技术和生物检测领域，具体涉及一种原位检测外泌体多重microRNA的纳米金荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术

乳腺癌是全世界女性中最常见的癌症，也是女性癌症死亡的主要原因。根据2018年全球癌症数据显示，乳腺癌占女性所有诊断癌症总数的24.2％及所有癌症死亡数中的15.0％，均位居第一。早期诊断、适当治疗、复发和转移监测对降低乳腺癌的死亡率非常重要。外泌体是细胞主动分泌的粒径为50～150nm的细胞外囊泡，具有脂质双分子层膜结构，通过其携带源细胞的DNA、mRNA、microRNA(miRNA)、蛋白质、脂质和代谢产物等与受体细胞进行细胞间的信息交流。miRNA是一类由内源基因编码的长度为18-25个核苷酸的非编码单链RNA，在细胞分化、增殖、凋亡，以及疾病过程等生物进程中起基因表达调控作用，诸多疾病的发生与miRNA的表达水平息息相关。近年来研究[参考文献：Lan H Y,Lu H Q,Wang X,et al.MicroRNAs as potential biomarkers in cancer:opportunities andchallenges BioMed Research International.2015,2015:1-17.Hannafon B N,TrigosoY D,Calloway C L,et al.Plasma exosome microRNAs are indicative of breastcancer.Breast Cancer Research.2016,18(1):90-104.Li X,Ren Z,Tang J,etal.Exosomal microRNA miR-1246promotes cell proliferation,invasion and drugresistance by targeting CCNG2 in breast cancer.Cellular PhysiologyBiochemistry.2017,44:1741-1748.Asaga S,Kuo C,Nguyen T,et al.Direct serumassay for microRNA-21concentrations in early and advanced breastcancer.Clin.Chem.2011,57:84–91.]报道了血浆/血清外泌体中的miRNA作为肿瘤的微创液体生物标志物，用于各种癌症的诊断、治疗和预后监测。乳腺癌细胞MCF-7分泌的外泌体有选择性富集其亲本细胞中miR-1246、miR-21、miR-122等miRNA的作用，且这些核酸的含量远远高于正常乳腺上皮细胞MCF-10A分泌的外泌体中相应miRNA的含量。通过从16个乳腺癌病人与健康对照组血浆提取外泌体分析，两者的miR-1246、miR-21的表达量均具有显著性差异，受试者特征工作曲线(ROC)显示血浆外泌体中miR-1246、miR-21表达量的组合优于单个指标，可作为乳腺癌诊断的生物标志物。

目前常用检测miRNA的方法主要有实时定量荧光PCR(RT-qPCR)、基因微阵列、Northern印迹法、高通量测序技术、原位杂交、基因表达系列分析、电化学发光等方法，每种方法都各有优缺点。当它们应用于血浆/血清外泌体内miRNA的测定，需要经过一系列繁琐的操作，如外泌体的提取、外泌体内RNA提取、逆转录合成cDNA等，对血浆/血清样品需求量较大，成本高，耗时费力，精密度与重现性较差。所以开发一种操作简便可原位检测血浆标本外泌体中miRNA的液体活检方法，将具有很好的临床应用前景。

发明内容