[发明专利]一种缺口DNA偏好性高保真聚合酶及其应用

说明书

本发明公开了一种缺口DNA偏好性高保真聚合酶及其应用。本发明公开了源自耐辐射奇球菌DNA聚合酶I的Klenow片段（KlenDr）的高保真聚合特性具有非3’‑5’校正外切活性依赖的特点，且具有结合缺口DNA的偏好性，不同于现有的商用高保真聚合酶。由于KlenDr对缺口DNA底物特异的亲和性，不会切除上游引物的3’末端，且很少替换下游核苷酸链，结合其高保真聚合特性，本发明提出KlenDr在核酸扩增，DNA缺口填充等基因工程操作以及测序文库的构建中将具有十分广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种缺口DNA偏好性高保真聚合酶及其应用。

背景技术

DNA聚合酶在分子克隆、DNA测序、文库构建等基因工程操作中具有广泛的应用价值，其准确复制DNA序列的能力至关重要。目前商业化应用的高保真DNA聚合酶大都依赖于3’-5’外切校正活性：当插入的核苷酸不符合Watson-Crick碱基互补配对原则时，不合适的空间构象会迫使新插入的核苷酸从聚合活性中心转移到3’-5’外切活性中心，从而切除该错误插入的核苷酸，以保证DNA复制的准确性。目前商业化应用的不依赖于3’-5’校正外切活性的高保真聚合酶尚缺乏。

DNA聚合酶通常偏好结合引物-模板结构的DNA，然而，随着生物技术的发展，人们对基因改造的需求多样性增加，例如基于T5转座酶的测序文库构建中需要补平接头与片段之间的缺口，而目前尚未见商业化的特异性偏好结合缺口DNA的聚合酶。此外，虽然多数聚合酶都可以填补缺口，但往往带有3’-5’校正外切核酸酶活性，会降解上游的3’末端。突变了外切校正活性的聚合酶虽然不降解上游核苷酸，但保真性又会有所降低，且替换下游核苷酸链（Strand Displacement）的活性也会增强。

DNA聚合酶I是人类最早发现的DNA聚合酶类，具有5’-3’核酸酶结构域、3’-5’ 外切核酸酶结构域和DNA聚合酶结构域（如图1所示）。大肠杆菌的DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶(或胰蛋白酶)处理后可分为34kDa的小片段和74kDa的Klenow片段。Klenow片段包含了3’-5’ 外切核酸酶结构域和DNA聚合酶结构域，是商业上广泛应用的一种DNA聚合酶。2007年，Heinz等人体外表达纯化了耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans R1）中与大肠杆菌Klenow片段同源的蛋白（KlenDr），报道了它的高保真聚合特性和微弱的链替换合成能力，但是并没有进一步的底物偏好性等研究，所以至今该聚合酶缺乏应用价值。

发明内容

针对目前基因工程和测序文库构建过程中对DNA聚合场景的多样性需求，本发明深入挖掘KlenDr的聚合特性，提供了缺口DNA偏好性高保真聚合酶及其应用。

一种缺口DNA偏好性高保真聚合酶，具有不依赖于3’-5’校正外切活性的高保真聚合特性，偏好结合缺口DNA，所述DNA聚合酶来源于耐辐射奇球菌Deinococcus radioduransR1，购自美国模式菌种保藏中心，编号：ATCC 13939，包含蛋白序列ID为ANC71194.1的第289-921位氨基酸，如SEQ ID NO .1所示。

所述的一种缺口DNA偏好性高保真聚合酶在核酸扩增中的应用，用于填补DNA缺口。

所述的核酸扩增体系的反应缓冲液为50~200 mM KCl，20~30mM Tris HCl pH 7.5~8.0，1~10 mM MgCl₂，0.1~0.5 mM dNTPs，0.1 mg/ml BSA，1 mM DTT。

所述的应用，核酸扩增体系的最适反应温度为25-37℃。

所述的应用，适用于包括需要填补DNA缺口的基因工程操作和测序文库构建。

所述的测序文库构建包括基于Tn5转座子的文库构建。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：