[发明专利]一种天然富硒农产品中有机硒的逐级提取方法

权利要求书

1.一种天然富硒农产品中有机硒的逐级提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，先将待提取的天然富硒农产品粉碎后，得到粉末，使用超纯水对粉末进行浸提，得到混合体系a，再将混合体系a离心后分离沉淀，得到沉淀物a和浸提液a；

步骤2，将沉淀物a使用超纯水进行浸提，得到混合体系b，再将混合体系b离心后分离沉淀，得到沉淀物b和浸提液b，将浸提液b与浸提液a合并后得到浸提液A；

步骤3，用两种不同孔径的超滤膜对浸提液A进行过滤，依次得到硒核酸粗提物、硒多糖粗提物和硒多酚粗提液；

按以下步骤对沉淀物b进行处理，得到硒代氨基酸提取液；

步骤3a，先将沉淀物b用NaOH溶液超声提取，得到混合体系c，再将混合体系c离心后分离沉淀，得到沉淀物c和提取液a，将沉淀物c用NaOH溶液超声提取，得到混合体系d，再将混合体系d离心后分离沉淀，得到提取液b，将提取液a和提取液b合并后得到提取液A；

步骤3b，调节提取液A的pH至硒蛋白的等电点，得到调节液；

步骤3c，将调节液离心后分离得到沉淀物d，再对沉淀物d进行酸脱蛋白处理，得到酸处理液；

步骤3d，将酸处理液依次涡旋和离心，得到沉淀物e；

步骤3e，在沉淀物e中加入Tris-HCl缓冲液进行超声提取，之后间隔性地加入胰蛋白酶和蛋白酶K，在恒温下震荡酶解，最后离心上清液得到硒代氨基酸提取液；

步骤4，依次采用步骤41a和步骤41b将硒多酚粗提液进行处理，得到硒多酚的易挥发组分和硒多酚的不挥发组分；采用步骤42将硒核酸粗提物进行处理，得到硒核酸；采用步骤43将硒多糖粗提物进行处理，得到硒多糖，完成天然富硒农产品中有机硒的逐级提取；

步骤41a，在硒多酚粗提液中加入环己烷进行涡旋混合，之后加入饱和氯化钠水溶液，振荡后在0～4度下离心，得到环己烷层和饱和NaCl层；

步骤41b，将环己烷层用环己烷-乙酸乙酯定容，得到硒多酚的易挥发组分；在饱和NaCl层中加入乙腈振荡提取后离心，将得到的混合液中的杂质去除，得到硒多酚的不挥发组分；

步骤42，先在硒核酸粗提物中加入NaCl溶液，将得到的混合体系e抽提后过滤，得到沉淀物f和滤液a，将沉淀物f按照硒核酸粗提物的处理方式重复2～4次，将得到的滤液与滤液a合并，得到滤液A，再将滤液A的pH调节至2～4，之后将调节pH后的滤液A在0～6℃下静置后分离沉淀，最后将该沉淀依次清洗和干燥，得到硒核酸；

步骤43，先在硒多糖粗提物中加入草酸溶液，将得到的混合体系f提取后过滤，得到沉淀物g和滤液b，将沉淀物g按照硒多糖粗提物的处理方式重复2～4次，将得到的滤液与滤液b合并，得到滤液B，再在滤液B中加入乙醇，之后将得到的混合液在0～6℃下静置后分离沉淀，最后将该沉淀清洗得到硒多糖。

2.根据权利要求1所述的天然富硒农产品中有机硒的逐级提取方法，其特征在于，步骤1中粉末与超纯水的比例为5g：25mL；步骤2中的超纯水用量与步骤1的超纯水用量相同。

3.根据权利要求1所述的天然富硒农产品中有机硒的逐级提取方法，其特征在于，步骤3先用50kDa孔径的超滤膜过滤浸提液A，将所述超滤膜上得到的固体冷冻干燥得到硒核酸粗提物，将得到的过滤液a用10kDa孔径的超滤膜过滤，将10kDa孔径的超滤膜上得到的固体冷冻干燥得到硒多糖粗提物，得到的过滤液b为硒多酚粗提液。

4.根据权利要求1所述的天然富硒农产品中有机硒的逐级提取方法，其特征在于，步骤3a中所述NaOH溶液中NaOH与步骤1中所述的粉末的比例为0.45mmol：5g；步骤3a中超声提取沉淀物b的NaOH用量与超声提取沉淀物c的NaOH用量相同。

5.根据权利要求1所述的天然富硒农产品中有机硒的逐级提取方法，其特征在于，步骤3b中用0.1mol/L的盐酸将提取液A的pH调节至4.0。

6.根据权利要求1所述的天然富硒农产品中有机硒的逐级提取方法，其特征在于，步骤3c中采用质量分数为5％的硝酸对沉淀物d进行酸脱蛋白，所述的硝酸与沉淀物d的比例为4mL：1g。